Étude d'un nouveau centre respiratoire putatif – Phox2RESP

-Ligne R2Flpo en construction à la Clinique de la souris
-Croisement pour obtenir Phox2b :: FLPo; Atoh1FRTCre; souris ROSAloxSTOPlox-GCaMP6f
-Croisement pour obtenir Phox2b :: FLPo; Atoh1FRTCre; Ai32 (ou; Ai35) animaux
-Traçage antérograde du peri5
-Fabrication d'un anticorps contre atoh1a / b. ISH avec Phox2b et atoh1a / b sur le cerveau du poisson zèbre.
-Validation de la ligne R2Flpo et croisement pour obtenir R2 :: FLPo; Atoh1FRTCre; Phox2blox / lox ; R2 :: FLPo; Atoh1FRTCre; Phox2b27Alacki et R2 :: FLPo; Atoh1FRTCre; VGlut2lox / lox.
-Définir l'activité spontanée des cellules peri5 dans les souris Phox2b :: FLPo; Atoh1FRTCre; ROSAloxSTOPlox-GCaMP6f
-Stimulation holographique de souris Phox2b :: FLPo; Atoh1FRTCre; Ai32 (ou; Ai35)
-Traçage rétrograde du peri5
-Tests de fragments de promoteur dans le poisson zèbre transgénique
-Analyse in vivo et in vitro de R2 :: FLPo; Atoh1FRTCre; Phox2blox / lox
R2 :: FLPo; Atoh1FRTCre; Phox2b27Alacki et R2 :: FLPo; Atoh1FRTCre; VGlut2lox / lox.
-Suppression chémogénétique de Phox2b :: FLPo; Atoh1FRTCre; RosaloxSTOPloxhM4Di-DREADD
-Traçage rétrograde du peri5 et identification des cellules présynaptiques.
-Tests de fragments de promoteur dans le poisson zèbre transgénique et création d'une ligne Gcamp6

- La construction des transgéniques R2 :: FLPo a été retardée.
- Nous trouvons que les mutants R2 :: cre; Phox2b27AlaCKI, qui ont un noyau Peri5 endommagé, ont à la naissance une altération de la respiration: la ventilation est réduite de moitié par la réduction des volumes marginaux, avec une fréquence respiratoire normale.

- Nous avons maintenant produit des mutants Phox2bFLPo; Atoh1FRTcre; Ai93 (GCaMP6f) pour enregistrer optiquement l'activité des neurones Peri5 dans des préparations et des tranches réduites de la moelle épinière.

Nous avons maintenant produit les génotypes Phox2bFLPo; Atoh1FRTcre; Ai32 (ChR2) et Phox2bFLPo; Atoh1FRTcre; Ai35 (Archaerhodopsin-3).

- Traçage antérogène des neurones Peri5
Nous avons montré que les neurones Peri5 ciblent sélectivement les motoneurones faciaux et hypoglosses, ispsilatéralement. Ces motoneurones innervent respectivement les muscles de la protrusion de la langue, l'ouverture de la mâchoire, l'abaissement de la lèvre et l'ingestion. Le traçage monosynaptique rétrograde du diaphragme et des muscles masséters indique que les neurones Peri5 ne sont pas prémoteurs ni pour les neurones moteurs trijumeau ni phréniques.

-Traitement anterograde des neurones RTN
Les terminaisons RTN ont été identifiées dans le Nucleus Tractus Solitarius (NTS), dans le noyau moteur dorsal du vague (Xm) et dans le complexe preBötzinger (preBötC). Des projections sur des structures pontines ont également été trouvées à proximité du noyau parabrachial / Kölliker-Fuse.

- Traçage rétrograde des neurones Peri5
Nous avons tenté de multiples stratégies pour obtenir un traçage rétrograde mono-synaptique des neurones Peri5. Nous avons réussi à obtenir une expression sélective de DG-Rb dans les neurones Peri5 avec deux stratégies, mais le rendement d’infection des neurones présynaptiques reste faible quels que soient nos efforts pour optimiser la complémentation G. Fait intéressant, une limitation comparable s'applique au RTN.

Nous utiliserons l'holographie numérique pour restreindre spatialement l'éclairage au Peri5 ou au RTN.

Nous évaluerons directement la ventilation et la survie des mutants Egr2 :: cre; R2 :: cre; Phox2b27AlaCKI dans l'air normal et hypercapnique.

- Stratégie supplémentaire pour le traçage antérogène des neurones Peri5 et RTN
Nous avons conçu une nouvelle méthode pour la traçage anterograde qui ne nécessite pas d'injections stéréotaxiques et pourrait avoir des utilisations plus générales. En bref, la construction permet l’expression combinatoire d'un fluorophore adressé à un domaine cellulaire spécifique. La recombinaison des cellules qui expriment uniquement une flippase entraînera une expression cytoplasmique de la tdtomato (rouge). Les cellules exprimant uniquement la recombinase Cre seront pas marquées, tandis que les cellules exprimant Flippase-ET Cre (intersection) exprimeront une protéine de fusion synapsine-GFP (vert). Les génotypes XFLPo; YCre double peuvent être utilisés pour visualiser les terminaisons axonales vertes sur des cellules rouges. Si X est choisi parmi les gènes qui définissent un type de cellule donné (p. Ex. Phox2b pour les neurones viscéraux), on peut révéler qu'un sous-ensemble Y des neurones Phox2b est connecté à des sous-ensembles non-Y de neurones Phox2b contribuant ainsi à la démonstration que les circuits viscéraux en grande partie s'appuient sur les synapses homotypiques Phox2b-Phox2b. Nous testons actuellement l'efficacité de la recombinaison Cre et FLPo à l'aide de la ligne Phox2bFLPo; Atoh1FRTcre.

Aucun pour l'instant

Ce projet consiste à élucider la fonction d’un groupe de neurones, définis génétiquement dans le cerveau postérieur des mammifères. Plus spécifiquement, notre étude ciblera un groupe de neurones dans le tronc cérébral (pont), sans doute impliqué dans la respiration. Au cours de travaux précédents sur le rôle du noyau rétrotrapézoide (RTN) dans la rythmogénèse respiratoire et dans le chémoréflexe (c’est-à-dire la réponse respiratoire à l’hypercapnie), nous avons identifié une petite population de neurones de même signature moléculaire que le RTN (exprimant les facteurs de transcription Phox2b et Atoh1) et une localisation apparentée (autour d’un noyau branchiomoteur, dans ce cas le noyau moteur du trijumeau plutôt que du facial), que nous appelons les neurones peri5. Plusieurs arguments suggèrent que ces neurones pourraient être impliqués dans la respiration et, qu’à tout le moins, leur disparition, combinée à celle du RTN, pourrait entrainer la mortalité néonatale des patients affectés par le syndrome d’hypoventilation centrale congénitale (CCHS) (causé par une mutation dans PHOX2B) ou de souris modèles de cette maladie. Le projet s’attaque à élucider la fonction de ces neurones. Grâce à la technique de transgénèse intersectionnelle utilisant les recombinases Flp et Cre, nous marquerons ces neurones spécifiquement, mesurerons leur activité spontanée, cartographierons leur connectome par traçage viral, les détruirons par des mutations conditionnelles, interfèrerons avec leur activité par chémogénétique chez le nouveau-né et l'adulte, et étudierons les conséquences de ses manipulations sur la respiration et les rythmes oro-faciaux. De plus, grâce à leur signature moléculaire partagée seulement avec le RTN, nous chercherons les homologues putatifs du RTN et du peri5 chez le poisson, comme première étape d'une étude évolutive de la rythmogénèse respiratoire à l’échelle cellulaire.