DS0408 - Étude des mécanismes de défense de l’organisme

Mécanismes de défense de l’organisme face à des allergènes cutanés réagissant au travers de processus non classiques : compréhension en allant de la molécule au tissu – DEFCHEMSKALL

DEFCHEMSKALL

Mécanismes de défense de l’organisme face à des allergènes cutanés réagissant au travers de processus non classiques : compréhension en allant de la molécule au tissu

Compréhension de la réactivité des allergènes via mécanismes radicalaires et modification de l'environnement épidermal activant les cellules du système immunitaire.

L'exposition aux allergènes et risque de sensibilisation sont une issue réglementaire obligatoire dans l'industrie. Il est donc essentiel de pouvoir prédire le pouvoir sensibilisant des composés avant leur utilisation. Afin de faire l'évaluation des risques, des études sur tous les mécanismes impliqués dans les réactions allergiques-inflammatoires, et les réponses cellulaires immunologiques associées, sont nécessaires pour couvrir toutes les catégories de molécules. Ce projet cherche à comprendre comment la réactivité des allergènes au travers de mécanismes radicalaires peut modifier spécifiquement l'environnement épidermal en fournissant de l'information aux cellules immunes qui vont alors activer le système immunitaire inné.<br />Une stratégie intégrée basée sur trois actions est proposée:<br />In chemico en étudiant la réactivité afin d'établir un profil complet de réactivité vis-à-vis des acides aminés pouvant réagir par voie radicalaire; in situ en étudiant le comportement et durée de vie des intermédiaires radicalaires formés dans des épidermes humains reconstruits; in cellulo en étudiant leur capacité à activer le système immunitaire, plus particulièrement les cellules dendritiques dans leur contexte environnant kératinocytaire, ainsi que des facteurs interindividuels de prédisposition.<br />Objectifs spécifiques:<br />• Profil de réactivité complet vis-à-vis d'acides aminés au travers de mécanismes radicalaires et dans un environnement peptidique<br />• Production de signaux de danger dans des épidermes humains reconstruits par résonance paramagnétique électronique (RPE)<br />• Impact de l'activation des cellules dendritiques DCs. Impact du «cross-talk« avec des kératinocytes<br />• Influence des «keratinocytes« non sains versus sains<br />• Etablir une correlation réactivité-activation DCs<br />• Développer un mode d'action pour évaluer le potentiel sensibilisant<br />Travail planifié en 5 tâches

Synthèse de produits; études de réactivité par RMN et CL-SM; production de radicaux in situ dans des épidermes humains reconstitués par résonance paramagnétique électronique (RPE) combinée au piégeage de spin; mesure des potentiels redox par voltampérométrie cyclique;activation des DCs dans la co-culture THP-1/HaCaT par PCR, Western Blot et cytométrie de flux; utilisation de lignés kératinocytaires différentes.

Les synthèses de produits désirés pour les études de réactivité par voie radicalaire sont pratiquement terminées. Dans plusieurs cas, les produits ont été obtenus grâce à des voies de synthèse multi-étapes. Des études préliminaires de réactivité vis-à-vis des acides aminés ont été entamées par chromatographie liquide combinée à la spectrométrie de masse. Nous avons identifié les intermédiaires radicalaires issus des composés sous étude à l'aide de la RPE et du piégeage de spin en solution. Nous avons identifié la formation de radicaux oxygénés mais aussi carbonés, étant le DEPMPO le piégeur de spin qui ait donné les résultats meilleurs. Les conditions expérimentales sont aujourd'hui optimisées afin de transférer la technologie à l'utilisation d'épidermes humains reconstitués.
Du point de vue des études in cellulo, l'activation des DCs dans la co-culture THP-1/HaCaT est pratiquement menée à terme avec des résultats positifs d'activation par les composés sous étude. Sont en cours: l'étude de l'activation de la voie Nrf2, l'analyse des surnageants cellulaires, l'analyse comparative d'activation avec les cellules MoDcs; l'étude avec des kératinocytes de donneurs atteints d'allergie ou de psoriasis est prêt et attend le feu vert du comité d'éthique.

Nous allons continuer avec les objectifs différents des tâches du projet, avec les perspectives suivantes dans un futur proche:
1. La synthèse des composés cibles est nouvelle, spécialement pour Lim-1-OOH, Citr-7-OOH et Citr-6-OOH. Une fois terminées, elles seront publiées avec l'identification de leurs intermédiaires radicalaires formés en solution.
2. Si les études de réactivité nous permettent d'élucider la formation d'adduits avec des acides aminés, ceci sera aussi l'objet d'une publication.
3. L'utilisation d'épidermes humains reconstitués pour l'étude de la formation in situ de radicaux à partir des allergènes considérés, à l'aide de la RPE, est un grand challenge. Dans un futur proche nous pensons avoir été capables de développer la méthode, qui sera importante à publier.
4. Les études d'activation des DCs dans la co-culture THP-1/HaCaT seront publiés une fois terminées en accord complet avec le Department of Environmental Toxicology de l' University of Trier.

L'objectif final du projet sera de coordonnér toutes les données obtenues, in chemico, in situ et in cellulo, afin de déveloper un mode d'action qui permette d'évaluer le potentiel sensibilisant de composés allergisant réagissant par voie radicalaire.

1. Non-classical mechanisms in skin sensitization: contribution of radical reactions to protein modifications by chemical allergens.
E. Giménez-Arnau.
Seminar Chemistry Department University of Trier. Trier, Germany (15th february 2016).
2. Non classical mechanisms in skin sensitization: the case of hydroperoxides derived from autoxidation of terpenes.
E. Giménez-Arnau.
13th Congress of the European Society of Contact Dermatitis.
Ibero-Latinoamerican Symposium.
Manchester, United Kingdom (14th-17th september 2016).
3. Fragrance terpenes sensitizing hydroperoxides: radical reactivity and Nrf2 pathway immune response.
E. Giménez-Arnau.
Cutaneous Allergy Research Group Organisation, CARGO Meeting
Stockholm, Sweden (19th november 2016).
4. An abstract sera soumis à 57th Annual Meeting of the Society of Toxicology, San Antonio, Texas, US (11th-15th march 2018) par partenaire University of Trier.

L’allergie cutanée représente un problème fréquent de santé publique, environnemental et professionnel. C’est une réaction d’hypersensibilité retardée causée par contact répété de la peau avec un éventail large de produits chimiques, naturels ou synthétiques. Elle est considérée comme la réaction d’immunotoxicité la plus courante chez l’homme. La prévalence est en hausse au niveau mondial. La pression sociale et la législation Européenne récente ont fait de l’exposition et du risque de sensibilisation aux allergènes une question réglementaire obligatoire pour l’industrie. Il est essentiel de pouvoir prédire le potentiel sensibilisant de tout produit chimique avant utilisation dans les produits de consommation. Dans ce contexte, la connaissance de tous les mécanismes chimiques induisant des réactions allergiques-inflammatoires et des réponses cellulaires-immunologiques associées s’impose afin de couvrir toutes les catégories de molécules sensibilisantes pour l’évaluation de risques.
Une allergie cutanée est le résultat d’une suite d’événements complexe. La première étape déterminante est chimique. Les allergènes (haptènes) doivent réagir avec les protéines cutanées pour former des conjugués antigéniques stables, qui seront reconnus et traités pour présentation au système immunitaire. Le mécanisme général fait intervenir la formation d’une liaison covalente entre l’haptène et les protéines via une réaction de type nucléophile-électrophile. Cependant, de nombreux allergènes ne cadrent pas dans ce modèle de réactivité. Des étapes biologiques clés sont l’activation des kératinocytes, cellules principales de l’épiderme et premières à entrer en contact avec l’allergène, et des cellules dendritiques présentatrices d’antigène (DCs) prenant en charge le complexe antigénique pour présentation aux cellules T.
DEFCHEMSKALL vise à comprendre comment la réactivité d’allergènes au travers d’autres mécanismes, impliquant des intermédiaires de type radicalaire, peut modifier les protéines cutanées et altérer spécifiquement l’environnement cellulaire en fournissant des informations aux cellules immunitaires qui vont activer le système immunitaire et induire la maladie. Notre hypothèse est que la réactivité chimique se traduit en une réponse biologique spécifique des keratinocytes et des DCs, qui dictera la réponse immunitaire aux allergènes réagissant par voie radicalaire.
A la lumière des considérations qui précèdent, le succès de DEFCHEMSKALL sera mesuré par les percées scientifiques obtenues en étudiant les mécanismes d’action de ces allergènes « de la molécule au tissu ». Une stratégie intégrée en trois volets est donc proposée : in chemico par l’étude du profil de réactivité complet vis-à-vis d’acides aminés capables de réagir par voie radicalaire ; in situ en étudiant, dans des modèles d’épidermes humains reconstruits, le comportement et la dégénérescence des radicaux formés; in cellulo en examinant leur capacité à activer le système immunitaire inné, à savoir les DCs dans leur contexte naturel kératinocytaire, ainsi que les facteurs de susceptibilité individuelle influençant le processus et ceci en analysant des keratinocytes sains versus des pathologiques.
Afin d’atteindre les objectifs, le projet est construit autour de deux axes majeurs de recherche interdisciplinaires et est divisé en 5 tâches chimiques-biologiques spécifiques interconnectées. Elles seront menées à terme par un consortium Franco-Allemand établi. Les études de réactivité chimique seront réalisées par le Laboratoire de Dermatochimie de l’Université de Strasbourg, et toutes les études biologiques et cellulaires seront réalisées dans le Department of Environmental Toxicology de l’Université de Trier. Avec l’intégration de l’ensemble de données obtenues et notre expertise, notre objectif est d’établir une stratégie permettant d’évaluer le potentiel sensibilisant d’allergènes précurseurs d’intermédiaires radicalaires, basée sur la réactivité chimique et l’activation des DCs.

Coordination du projet

Elena GIMENEZ-ARNAU (Laboratoire de Dermatochimie - Université de Strasbourg)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

University of Trier - Germany Department of Environmental Toxicology
Institut de Chimie - UNISTRA Laboratoire de Dermatochimie - Université de Strasbourg

Aide de l'ANR 194 747 euros
Début et durée du projet scientifique : mars 2016 - 36 Mois

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