ANALYSE DYNAMIQUE DE L'ACTIVITÉ ORGANISATIONELLE DE HEDGEHOG CHEZ LA DROSOPHILE – HHMOVE

Les divers mécanismes de transport que Hh pourrait utiliser méritent une analyse détaillée à l'échelle du génome pour mieux comprendre les mécanismes distincts que Hh pourrait utiliser pour sortir de la cellule. Pour combler cette lacune, nous avons réalisé un criblage à l'échelle du génome chez la drosophile. Pour cela, nous avons utilisé une collection de lignées transgéniques interférant ARN inductibles permettant d’éteindre la fonction de chaque gène ciblé spécifiquement dans les cellules productrices de Hh. En parallèle, en utilisant la microscopie immunoélectronique sur les disques imaginaux de l'aile de la drosophile, nous avons analysé la distribution de la molécule Hh au niveau sub-cellulaire.

Nous avons pu compléter un crible à l'échelle du génome pour le sécrétome de Hh chez la drosophile, ce qui nous a permis d'identifier un nouveau régulateur du trafic apico-basal de Hh, la petite GTPase Rab8. Nous montrons que l'activité Hh est fonctionnellement distribuée entre les différentes populations de Hh sécrétées apicalement et latéralement, chacune activant respectivement des cibles à longue et courte distance de la source.
En utilisant la microscopie électronique sur les disques imaginaux de l'aile de la drosophile, nous avons identifié une structure cellulaire, les Hhérisomes qui contiennent la majorité de la molécule Hh dans les cellules produisant et sécrétant Hh. Nous montrons que ces Hhérisomes sont des endosomes tubulaires impliqués dans le recyclage. Nos données indiquent que les Hhérisomes sont nécessaires pour maintenir l'activité physiologique de Hh nécessaire à l’organisation et à la croissance des tissus dans le disque de l'aile.
Du point de vue algorithmique nous avons développé un logiciel pour détecter de façon précise les filopodia, sur lesquelles se déplacent Hh, à partir d'imagerie confocale. Cette détection est associée à une analyse statistique qui permet de calculer le nombre d'extensions, leur longueur ou encore leur distance maximale par rapport à la membrane cellulaire. Nous avons par ailleurs calibré un logiciel fondé sur les processus ponctuels marqués pour détecter les particules Hh au sein des disques imaginaux.

Des études chez les vertébrés ont montré que Hh est impliqué dans divers processus biologiques englobant le développement embryonnaire, la biologie des cellules souches et l'homéostasie tissulaire (Briscoe et Thérond, 2013). La dérégulation de la voie Hh s'est avérée être responsable de syndromes congénitaux et l'activité persistante de la voie Hh a des conséquences pathologiques dans divers cancers (Beachy, et al., 2004). Des efforts sont faits pour comprendre et manipuler la sécrétion aberrante de Hh sur le tissu sensible environnant et la cascade de signalisation en aval de l'activation du récepteur de ligand. Par conséquent, nos travaux apporte une meilleure compréhension de la régulation de la sécrétion de Hh, et pourrait ouvrir de nouvelles voies pour la découverte d'outils thérapeutiques pertinents pour le traitement d'une grande variété de pathologies dépendant de Hh.

Organisation d’un symposium:

- Labex Signalife Workshop “Distant Intercellular Communications” (June 24th; 2019).

Ces travaux sont présentés dans 3 Publications :

Tamas Matusek et al.,. Functional analysis of ESCRT-positive extracellular vesicles in the Drosophila wing imaginal disc. Methods in Molecular Biology 2019;1998:31-47, edited by Springer.

Tanvi Gore et al.,. Role of the small GTP-ase Rab8 in the establishment of Hedgehog long- and short-range activity. (Development, 2021 Mar 9;148(5).

Sandrine Pizette, et al., under press in Journal of Cell Science. Identification of a new Hedgehog-containing endocytic compartment required for high level Hedgehog signaling and tissue growth.

Le développement embryonnaire nécessite la sécrétion et la propagation de molécules de signalisation extracellulaires. Dans ce contexte, des ligands Hedgehog (Hh) exercent des fonctions importantes allant de la régionalisation de l'aile de la Drosophile à l'organisation du système nerveux des vertébrés et la maintenance de cellules souches. Parmi les caractéristiques distinctifs des ligands Hh figure leur activité morphogénétique, c’est à dire leur capacité à induire différents gènes cibles en fonction de la distance de la source de ligand. Les signalisations à courte et longue distance impliquent des populations de ligand différentes sécrétées dans l'espace extracellulaire apical ou baso-latéral. Par des approches génétiques, biochimiques et ultrastructurales, nous avons démontré qu'une fraction importante de la population extracellulaire de Hh est associée à des vésicules extracellulaires. Nos données fonctionnelles suggèrent que des exovésicules jouent un rôle important dans la sécrétion et la signalisation Hh (partenaire 1 : Pascal Thérond). Néanmoins, d’autres transporteurs de Hh ont été identifié (particules de lipoproteine; extensions membranaires appelées cytonemes). L'objectif de ce projet est de caractériser les mécanismes de sécrétion de Hh et plus particulièrement de comprendre les différences de régulations entre les différentes populations de Hh et la contribution individuelle des différents transporteurs dans ce processus.
Pour étudier ces mécanismes, nous allons développer de nouvelles méthodes pour modifier les propriétés spatio-temporelles et dynamiques du gradient Hh extra-cellulaire et séparer la contribution apicale et basale des populations de Hh dans deux épithéliums différents de la larve de drosophile. Cela nous permettra d'analyser la contribution des différents transporteurs dans l'établissement du gradient Hh (P. Thérond et partenaire 2 : Xavier Descombes, INRIA Sophia-Antipolis ). Ceci sera complété par un crible génomique pour identifier de nouveaux gènes responsables de la sécrétion de Hh (P. Thérond). Avec ces outils, nous proposons de classer les différentes populations de Hh et de développer de nouveaux algorithmes de suivi de particules pour comparer les trajectoires des différentes populations de Hh (X. Descombes). L'intérêt particulier de cette collaboration réside dans la combinaison de développement d'algorithme avec l’analyse génétique puissant et la manipulation in vivo chez la drosophile. Notre projet pourrait identifier de nouvelles pistes pour la découverte d'outils thérapeutiques pertinents pour la santé humaine puisqu’une dérégulation de l'activité Hh induit l’altération de cellules souches et de l'homéostasie tissulaire. Une compréhension de la signalisation Hh est donc d'un intérêt aussi bien fondamental que médical.