Régulation transcriptionnelle par séquestration nucléolaire – NucleoReg

Le programme de recherche aura ainsi pour but de démontrer plusieurs points ayant pour but de comprendre le rôle du nucléole dans la régulation des régions génomiques qui lui sont associés. Dans un premier temps, nous allant étudier la dynamique de la composition des NADs en analysant leur composition:
? Dans différents types cellulaires
? Lors de phases de transitions physiologiques de la plante (comme par exemple la phase juvénile à adulte),
? Dans différentes conditions de stress abiotiques (comme la chaleur)
Dans ces cas, un marqueur nucléolaire fusionné à la GFP permettra marquer les nucléoles in planta, ainsi de les purifier par la technique de FANoS (Fluorescent Assisted Nucleoli Sorting). Cette approche que j'ai mis au point il y a quelques années permet de purifier de manière très pure les nucléoles à partir de n'importe quel tissu de plantes, et ce grâce à un cytomètre de flux trieur à épifluorescence.

Dans un second temps, nous cherchons à élucider les mécanismes permettant à ces régions d’être associés au nucléole. Ainsi, en réintégrant certaines de ces régions dans d’autres contextes génomiques, nous pourront ainsi déterminer si la séquence d’un NAD peut-être suffisante pour induire son association au nucléole, ou si le contexte génomique du NADs joue également un rôle important dans son association. Nous étudierons également l’influence des modifications épigénétiques sur l’association de ces régions au nucléole en analysant les NADs dans différents mutant impliqués dans l’organisation du génome.

Dans un troisième temps, nous avons pour but de développer des outils qui permettront de détecter des NADs à l'échelle cellulaire, par des techniques d'imagerie.
Deux approches sont développées:
(i) ANCHOR: une cassette unique qui permet de visualiser le site d'intégration de l’ADN-T.
(ii) dCAS9 / CRISPR: une cassette qui permet de visualiser un site d'intérêt par l'intermédiaire de l'hybridation d'ARN guides.

Nous avons analysé le contenu en ADN du nucléole en partant de feuilles d’A. thaliana. Les nucléoles ont été isolés par la technique de FANoS et séquencer dans le contexte d’une plante sauvage, ainsi que dans le mutant nucleolin 1 (nuc1). Au final, nos travaux ont déjà permis d’identifier pour la première fois les NADs (Nucleolus Associated chromatin Domains) dans le contexte d’un organisme entier. Hormis les gènes d’ARNr, les NADs correspondent à 4% du génome, essentiellement composés de régions de types hétérochromatiques. Près de la moitié de ces régions correspond à des éléments transposables, mais nous avons également identifiés environ 900 gènes peu ou pas exprimés. Hormis l’identification et la caractérisation des NADs chez A. thaliana, cette approche a permis de révéler 2 autres points majeurs : (1) le rôle du nucléole et de la protéine NUC1 dans l’organisation spatiale de l’hétérochromatine au sein du noyau et (2) le rôle du nucléole et de NUC1 dans la biologie des télomères. Ce travail a fait l’objet d’une publication dans la revue Cell Reports (Pontvianne et al., 2016).

Par ailleurs, des résultats préliminaires semblent indiqués que l'approche ANCHOR que nous développons permet effectivement de suivre in planta des gènes simple copie. Nous sommes actuellement en train de réaliser tous les contrôles afin de valider la spécificité de cette approche.

L'analyse de la dynamique des NADs est en cours, et permettra de déterminer l'impact de l'association des NAD-gènes sur leur expression, et ce dans différents contextes génomiques, cellulaires, ou en cas de stress.

La perspectives de pouvoir analyser la position de gènes simples copies au sein d'une plante entière devrait permettre de valider à l''échelle de la cellule unique l'association des NAD-gènes avec le nucléole. Cependant, cette approche ouvre des perspectives plus larges qui dépassent le simple cadre de ce projet. En effet nous pourrons également utiliser ces approches pour déterminer la dynamique de la position des gènes en cas de variation d'expression.

Pontvianne F#, Carpentier MC, Durut N, Pavlištová V, Jaške K, Schorová S, Parrinello H, Rohmer M, Pikaard CS, Fojtová M, Fajkus J and Sáez-Vásquez J. (2016) Identification of nucleolus-associated chromatin domains reveals the role of the nucleolus in the 3D organisation of the A. thaliana genome. Cell Reports. August 9 (16) doi:10.1016/j.celrep.2016.07.016

Mohannath G, Pontvianne F, Pikaard CS. (2016) Selective nucleolus organizer inactivation in Arabidopsis is a chromosome position-effect phenomenon. Proc Natl Acad Sci U S A. Nov 22;113(47):13426-13431.

Picart C, Pontvianne F. (2017) Plant nucleolar DNA: Green light shed on the role of Nucleolin in genome organization. Nucleus. Jan 2;8(1):11-16. doi: 10.1080/19491034.2016.1236167.

Pontvianne F#, Boyer-Claver M, Sáez-Vásquez J. (2016) Fluorescence-Activated Nucleolar Sorting in Arabidopsis. Methods Mol. Biol.1455:203-11. doi: 10.1007/978-1-4939-3792-9_15.

Plusieurs niveaux de régulation influent sur l’expression des gènes. Ainsi, la position relative d’un gène au sein du noyau impacte sur son expression. Ce projet a pour but de mettre à jour le rôle du nucléole dans l'expression de certains gènes lors du développement et en réponse aux stress chez les plantes. Le nucléole est un large compartiment nucléaire qui créer un grand volume d'où l'ARN polymérase II est exclue. Cependant, des régions chromosomiques autres que celles possédant les gènes d'ARN ribosomiques sont associées au nucléole (NAD pour Nucleolus-Associated Domains). Par de nouvelles techniques permettant d’isoler les nucléoles provenant de différents tissus de la plante, j’ai identifié les NADs dans des cellules de feuilles. A l’instar d’éléments répétés provenant de régions péri-centromériques, des NADs contenant des gènes non-exprimés dans les feuilles ont été découverts. L’ARN polymérase II étant exclue du nucléole, cela suggère que ces gènes sont séquestrés dans le nucléole pour empêcher leur transcription. L’organisation nucléaire étant très dynamique, je propose d’identifier les NADs dans différents types cellulaires et au cours du développement. Par ailleurs, en cas de stress, les plantes n'ont pas d'autres alternatives que de faire face et de s'adapter à leur environnement car leur survie en dépend. Au niveau moléculaire, cette réponse se traduit notamment par une réorganisation nucléaire et une variation de l'expression des gènes. En conséquence, nous étudierons l’impact de la régulation transcriptionnelle par séquestration nucléolaire en cas de stress.
Afin de valider les résultats obtenus via ces approches globales, le positionnement de ces NADs sera ensuite étudié à l’échelle de la cellule. Pour cela, je propose de développer de nouvelles techniques d’imagerie réalisables in planta qui permettront de détecter le positionnement d’un gène simple copie. Parmi les gènes présents dans le NADs, nombreux sont ceux exprimés dans d’autres types cellulaires ou après un stimuli biotique ou abiotique.
Grâce aux protocoles d’imagerie développés dans ce projet, nous pourrons suivre en temps réel la position d’un gène lors de son activation transcriptionnelle, comme en cas de stress, et ainsi valider que cette activation est bien liée à la perte de son association physique au nucléole. Un crible génétique complètera cette étude et permettra d’identifier les facteurs impliqués dans la séquestration des NADs.
En résumé, ce projet pourrait révéler l’existence d’une nouvelle voie de régulation transcriptionnelle des gènes par séquestration nucléolaire et de démontrer l’impact de cette voie lors du développement et de l’adaptation des plantes.