Méthodes de peignage moléculaire à haut débit pour une cartographie rapide de la réplication du génome humain – LIGHTCOMB

La cartographie des origines de réplication et de la progression des fourches de réplication dans les génomes animaux reste une des questions les plus difficiles de la biologie moléculaire moderne. Bien que les méthodes génomiques permettent désormais de cartographier la position des origines ou la chronologie de réplication du génome entier, les études indépendantes montrent encore de nombreuses discordances. De plus, ces méthodes ne fournissent qu'un image moyenne de la réplication dans des populations de cellules, alors qu'il est clair que chaque cellule utilise une cohorte différente d'origines pour répliquer son génome. Seules les méthodes d'analyse de molécules uniques comme le peignage moléculaire de l'ADN permettent d'obtenir des informations sur la variation des profils de réplication d'une cellule à une autre. Quand l'ADN génomique est soumis à un marquage métabolique avec des précurseurs marqués, le peignage moléculaire permet de visualiser la distribution des origines de réplication et la progression des fourches de réplication le long des molécules d'ADN étirées sur une lame de verre silanisée. De plus, l'hybridation in situ fluorescente (FISH) des fibres peignées permet de visualiser directement la position des origines et des fourches dans le locus ainsi sondé, ce qui peut permettre de résoudre les discordances fréquentes observées entre différentes techniques génomiques de cartographie de la réplication. Cependant, le peignage moléculaire reste une technique lente et laborieuse, particulièrement dans le cas des génomes complexes des mammifères. Le but de ce projet est de développer de nouvelles méthodes pour augmenter le rendement et la précision cartographique du peignage de l'ADN et l'amener ainsi à la même puissance que les autres méthodes génomiques, afin de quantifier l'initiation, la terminaison et la progression des fourches tout au long du génome chez la levure, le xénope et l'homme. Ceci permettra de contraster les stratégies de réplication de ces organismes et fournira des bases de données inestimables pour examiner les liens entre réplication, transcription et instabilité génomique. De nouvelles méthodes basées sur la microscopie de haute résolution (microscopie de fluorescence, TIRF-SRP, microscopie à force atomique), l'utilisation de marqueurs fluorescents, soit pour leur intercalation quantitative et non spécifique dans l'ADN, soit pour l'identification de séquences d'ADN spécifiques, et la microfluidique, offrent la possibilité de cartographier rapidement la position des fourches de réplication et d'identifier la position génomique d'une population entière de molécules d'ADN étirées, sans requérir les étapes compliquées de traitement des fibres qui limitent actuellement les techniques de molécule unique. L'automatisation des outils de traitement des images (analyse morphologique, transformation en ondelettes directionnelle) et de cartographie sur le génome (alignement de profils de restriction) permettra une analyse à haut débit. Le développement par étapes de ces techniques nous permettra (i) de quantifier et raffiner notre compréhension de l'utilisation des origines chez la levure et le xénope; (ii) de valider le "modèle en cascade" que nous avons proposé pour la réplication des N/U-domaines du génome humain; (iii) d'étudier la progression des fourches tout au long du génome et d'explorer ses liens avec la transcription et l'instabilité génétique; (iv) de cartographier la réplication de régions fortement répétitives mal étudiées. Les résultats devraient clarifier l'organisation réplicative du génome humain et l'impact de la réplication sur la stabilité génomique et fournir à la communauté scientifique de nouvelles bases de données ainsi que des outils simples et accessibles pour cartographier la distribution des bulles de réplication et des segments non répliqués dans n'importe quelle cellule de n'importe quel organisme.