Dynamique fonctionelle d'une nanomachine impliquée dans la qualité du protéome: une étude croisée SAXS/SANS/RMN sur l'unfoldase PAN – PROTstretch

Ce projet ANR utilise une combinaison innovatrice de RMN, SAXS/SANS et fluorescence pour étudier des changements conformationnels et de l'enzyme «unfoldase« PAN et de son substrat GFP lors du processus de dépliement. Ces approches principales sont complétées par plusieurs techniques biophysiques comme l'AUC, SEC-MALLS, SPR et autres afin de caractériser la monodispersité et la pureté des échantillons.

Après 18 mois nous avons enregistré un premier jeu de données SAXS/SANS qui permet une déscription des changements conformationnels et de l'unfoldase PAN et du substrat GFP lors du processus de dépliement en fonction du temps. LE projet a aussi stimulé le développement d'un outil unique de fluorescence en ligne qui permet d'enregistrer des données spectroscopiques en parallèle aux neutrons à l'Institut Laue-Langevin à Grenoble.

L'approche méthodologique développée dans ce projet ANR (combinaison de RMN et SAXS/SANS, résolu en temps) pourra être appliquée à une vaste gamme de complexes biologiques impliqués dans la remodélisation du protéome.

Time-resolved neutron scattering provides new insight into protein substrate processing by a AAA+ unfoldase. (2017) Ibrahim Z, Martel A, Moulin M, Kim HS, Härtlein M, Franzetti B, Gabel F. Sci Rep. 7:40948.

Le but du présent projet franco-allemand PRCI est d'obtenir des renseignements sur la fonction moléculaire d'une classe importante de machines biomacromoléculaires, les AAA ATPase machines de dépliement ("unfoldases").

Un protéome en bonne santé, c'est à dire l'ensemble des protéines présent à un moment donné dans une cellule biologique, est essentiel pour le bon fonctionnement de tous les organismes. Un grand nombre de mécanismes existent au niveau post-traductionnel de l'expression qui contrôlent la quantité, la spécificité et l'activité des protéines en fonction d'un environnement externe et interne variable. Dans des cellules vivantes, un de ces mécanismes consiste en rattrapent et détruisant des protéines endommagées. Cette fonction est critique puisque des protéines repliées d'une façon erronée ont une tendance à agréger et peuvent engendrer des dommages irréversibles à la cellule. Le défi majeur d'une dégradation spécifique des protéines consiste en dépliant et éliminant des protéines avec un état conformationnel erroné ou que la cellule ne nécessite plus. Cette tâche est assurée par de diverses classes de AAA ATPases déplieuses ("unfoldases") qui préparent des protéines à la destruction pour le protéasome.

Grâce à leur rôle central dans les chemins de dégradation des protéines, les unfoldases sont actuellement discutées comme cibles potentielles pour une intervention thérapeutique. Chez les humains, un dysfonctionnement dans l'élimination des protéines erronées peut provoquer de nombreuses maladies neurodégénératives comme Alzheimer ou Huntington et est aussi à la base des maladies infectieuses comme des prions. Des maladies neurodégénératives, en particulier, sont plus probable chez les personnes âgées, ce qui représente un problème majeur pour une population mondiale vieillissante. Dans ce contexte la compréhension en détail des mécanismes moléculaires des unfoldases représente un défi majeur en biomédecine.

Des techniques classiques en biologie structurale, telle que la cristallographie, sont limitées quand elles sont appliquées à de tels systèmes complexes, dynamiques et oligomériques et ne peuvent fournir une compréhension complète de leur fonctionnement. Ici, nous proposons d'aborder ces questions par une combinaison puissante de techniques de biologie structurale: diffusion de petits angles de rayons X (SAXS) et de neutrons (SANS). Nous proposons d'appliquer cette approche sur le système PAN avec la GFP comme substrat. PAN est l'analogue archéen du système eucaryote 19S associé avec le 26S protéasome. C'est une unfoldase hexamèrique de 250 kDa avec une structure intéressante sous la forme d'une demi-sphère creuse avec six protubérances. A ce jour, le complexe a résisté à la cristallisation et des modèles homologues sont seulement disponibles pour des sous-unités.

Le consortium est dans une position unique en France et Allemagne pour élucider la structure et la fonction de "unfoldase" de PAN et pour développer de nouvelles approches en combinant des techniques complémentaires de la biologie structurale moléculaire. Le deux coordinateurs sont des experts reconnus au niveau international en SAXS/SANS et en RMN, respectivement, et ont collaboré dans le passé sur des projets impliquant des grands complexes difficiles. Les deux groupes sont parfaitement complémentaires: le groupe "Carlomagno" est spécialisé en RMN structurale des grands complexes biomacromoléculaires et a de l'accès aux spectromètres à haute performance, tandis que le groupe "Gabel" sont des experts et dans la biochimie du système PAN et dans les techniques SAXS/SANS avec un accès régulier et aisé aux grands instruments locaux tels l'ESRF et l'ILL.