DS0401 - Etude des systèmes biologiques, de leur dynamique, des interactions et inter-conversions au niveau moléculaire

Bases structurales des modifications de la synthèse lipidique induites par la Viperin au cours de l'infection virale – VipVir

Bases structurales des modifications de la synthèse lipidique par la viperin au cours de l’infection virale

Les lipides sont présents à toutes les étapes du cycle viral, de l’entrée, la transcription, la translation, l’assemblage et le bourgeonnement. Ils jouent un rôle crucial dans la réplication viral et sont donc une cible intéressante pour le développement de nouvelles stratégies antivirales. Les protéines issues de la stimulation des gènes par l’interféron ne font pas exception et en particuliers la viperin, objet de notre étude, qui semble interférer avec le mécanisme de biosynthèse des lipides.

La viperin semble agir sur la diminution du cholesterol cellulaire, entrainant une inhibition du bourgeonnement viral. Nous proposons de découvrir son substrat et de comprendre son mécanisme d’action.

La Viperin (virus inhibitory protein, endoplasmic reticulum-associated, interferon-inducible) est une protéine issue de la stimulation des gènes par l’interféron et qui possède une activité antivirale contre de nombreux virus pathogènes enveloppés comme le cytomégalovirus, le virus influenza A, de la dengue et le VIH-1. Son mode d’action précis est encore incompris mais de nombreuses études indiquent son implication dans la biosynthèse des lipides et la modulation des membranes, affectant la réplication des virus enveloppés. Elle a la caractéristique de contenir un agrégat fer-soufre dans son domaine SAM radical (S-Adenosylméthionine) catalytique. Les enzymes de type SAM radical utilise la réduction d’un électron de l’agrégat Fe4S4 afin de cliver la SAM et produire la méthionine et un radical très réactif le 5’-deoxyadenosyl (5’dA.), lui-même capable d’initier des réactions de chimie radicalaire sur de nombreux substrats.<br />Notre projet contient 3 objectifs, le premier nous permettra de comprendre comment l’expression de la viperin interfère avec le processus de biosynthèse des lipides au cours de l’infection des cellules par le virus de la grippe A. Nous nous focalisons sur l’identification du substrat de la viperin ainsi que sur le produit modifié par cette même réaction et la caractérisation structurale du mécanisme qui semble bloquer la formation de cholestérol et ainsi le bourgeonnement viral.<br />Le 2eme objectif est d’étudier l’interaction entre la viperin et la mitochondrial trifunctional protein (TFP), qui est exploitée par le cytomegalovirus humain afin de surproduire des lipides et ainsi augmenter sa capacité infectieuse.<br />Le 3eme objectif comprend une complémentation fonctionnelle du travail structural décrit dans les 2 premiers objectifs, par des méthodes de biologie cellulaire afin d’expliquer in vivo nos résultats structuraux.

Nous avons cloné et purifié en milieu aérobie différentes construction de viperin humaine et d’organismes homologues en incluant ou non l’hélice N-terminale amphipathique. Les constructions entières ont été purifiées en présence de détergent et en particuliers de DDM (N-dodecyl ?-D-maltoside).
La reconstitution du centre Fe4S4 à l’aide de l’ajout de FeCl3 et de Na2S en excès molaire est réalisé en milieu anaérobie au sein de boites à gants Jacomex situées dans le laboratoire métalloprotéines de l’Institut de Biologie Structurale, dirigé par Yvain Nicolet avec qui nous collaborons. Toutes les étapes de purification sont alors conduites en absence d’oxygène.
Nous avons réalisé des tests de cristallisation grâce aux plateformes de l’IBS et du PSB (Partnership for Structural Biology).
Afin d’identifier le substrat de la réaction de la viperin, nous avons mis en place un test enzymatique pour mesurer la formation de radical 5’dA par la viperin en présence de SAM et d’un fort agent réducteur le dithionite. Le produit de la réaction est ensuite purifié et identifié par HPLC couplé à de la spectrométrie de masse et d’un détecteur de fluorescence avec une longueur d’émission à 280nm et une émission à 395nm, caractéristiques du 5’dA.
Le test d’inhibition de la FPPS, enzyme de la voie du mévalonate a été réalisé grâce à la particularité qu’a cette enzyme de libérer des pyrophosphates au cours de sa réaction. Ces pyrophosphates sont transformés en orthophosphates par une pyrophosphatase et sont ensuite dosés par une réaction colorimétrique le malachite green. Les résultats sont lus sur un spectrophotomètre à 620nm.

Notre collaboration avec le groupe métalloprotéines de l’IBS nous a permis de mettre en place des protocoles de purification et de reconstitution de différentes constructions de viperin humaine ou issue de différents organismes homologues. Ces protocoles sont maintenant robustes et nous ont permis d’entreprendre différents tests de caractérisation biophysique et biochimiques. En particuliers, nous avons mis en évidence une plus grande stabilité de la viperin de faucon après reconstitution qu’avant la reconstitution de son centre Fe4S4 avec une augmentation de sa température de stabilité de 10°C. Les tests de cristallisation des protéines avant ou après reconstitution sont actuellement en cours et n’ont pour l’instant pas aboutis.
De nombreux efforts ont été consentis sur des constructions de viperin entière, contenant son hélice N-terminale amphipathique, en particuliers sur la protéine humaine et celle de chinchilla. L’usage de détergent est requis à toutes les étapes d’extraction et de purification de la protéine qui ont été réalisés avec succès et les tests de cristallisation de ces constructions sont actuellement en cours.
Nous avons par ailleurs découvert un substrat potentiel de la viperin qui est un produit de la réaction de la voie du mévalonate. Ce précurseur lipidique serait modifié par la réaction de chimie radicalaire induite par le 5’dA produit par la réaction entre la viperin et la SAM. Cette molécule modifiée bloquerait ensuite une enzyme de la voie du mévalonate afin de bloquer la synthèse de cholestérol et ainsi le bourgeonnement viral. Cette découverte majeure va nous permettre d’expliquer comment la viperin agit sur l’inhibition du bourgeonnement des virus enveloppés.
Les premiers tests d’inhibition de cette molécule modifiée sur la FPPS, une des enzymes de la voie du mévalonate, n’a pas montré d’inhibition. Nous testons actuellement d’autres enzymes en aval de la FPPS.

Nous avons découvert de façon fortuite un des substrats de la viperin impliqué dans la perturbation de la voie du mévalonate induisant la perturbation de la production de cholestérol et ainsi inhibant le bourgeonnement du virus influenza. Nous collaborons actuellement avec Amaury du Moulinet d’Hardemare du département de chimie moléculaire de l’Université Grenoble Alpes afin d’identifier ce substrat modifié par la viperin par des techniques de RMN, spectrométrie de masse et chromatographie en phase liquide.
Lorsque cette molécule modifiée sera identifiée, nous tenterons de cristalliser la protéine viperin avec cette molécule et son co-substrat connu la SAM, afin de comprendre le mécanisme d’action de la viperin.
Nous identifierons également l’enzyme de la voie du mévalonate qui est inhibée par cette molécule modifiée afin de comprendre le mécanisme d’inhibition de production de cholestérol. Nous testerons différentes enzymes de la voie du mévalonate grâce au test colorimétrique «malachite green» indiqué précédemment ainsi que la capacité d’interaction entre l’enzyme identifiée et notre molécule, à la fois par résonnance plasmonique de surface et thermophorèse.
Enfin, nous testerons les effets inhibiteurs de notre produit sur l’inhibition de pseudo-particules virales produites par les protéines Gag du VIH, production dont nous avons la maitrise au laboratoire. Nous nous attendons à ce que l’addition de notre molécule modifiée par la viperin bloque la voie du mévalonate, induisant la réduction de formation de cholestérol et ainsi bloque significativement le bourgeonnement des pseudo-particules virales. Ceci pourra être mis en évidence par le dosage des protéines Gag intracellulaire et par microscopie électronique.

N/A

La viperin (Virus inhibitory protein, endoplasmic reticulum-associated, interferon –inducible) est le produit d’un gène stimulé par l’interféron qui possède une activité antivirale contre une variété de virus pathogènes enveloppés tels que le cytomégalovirus, le virus Influenza A, le virus de la dengue, et le VIH. Son mode d’action précis est encore méconnu mais de nombreuses preuves tendent à montrer son implication dans la biosynthèse des lipides et la modulation de la membrane engagée dans la réplication des virus enveloppés. En effet, les lipides sont présents à toutes les étapes du cycle du développement viral, incluant l’entrée, la perte de l’enveloppe, la transcription, la traduction, l’assemblage et le bourgeonnement viral. Ainsi, la modulation de la structure des membranes et de leur composition est une cible intéressante pour le système immunitaire ainsi que pour le développement de nouveaux médicaments.
Je me propose de réaliser une étude de biologie structurale intégrative à plusieurs niveaux dans le but de décrypter le rôle de ce nouveau facteur de restriction antiviral et son implication dans l’homéostasie des lipides. Mon premier objectif sera de comprendre le mécanisme pas lequel la viperin interfère avec le processus de biosynthèse des lipides au cours de l’infection par le virus influenza. L’expression de la viperin engendre un arrêt du bourgeonnement du virus de la grippe, dû à l’inhibition de la Farnesyl diphosphate synthase (FPPS) par la viperin, la FPPS étant un facteur cellulaire régulant l’homéostasie des lipides. Ce premier objectif inclus la caractérisation fonctionnelle et structurale de la viperin, une enzyme de type SAM-radical (S-adenosyl-L-methionine) en complexe avec son cofacteur SAM, son centre [4Fe-4S] et son partenaire FPPS. Ce premier objectif sera réalisé avec l’aide des équipements d’expression, de purification et de cristallisation en milieu anaérobie disponible sur notre campus. Cette caractérisation structurale permettra d’avoir accès à la première structure d’une enzyme SAM-radical eucaryote et nous permettra de comprendre les détails moléculaires de l’inhibition de la FPPS par la viperin, ce qui constituera la point d’ancrage pour la compréhension de son rôle dans l’inhibition du bourgeonnement viral. Ce travail structural sera complémenté par des études structure-fonction décrites dans l’objectif 3, qui seront réalisées par mes collaborateurs, et ayant pour but de mieux comprendre les effets de la surexpression de la viperin sur le bourgeonnement du virus influenza. Mon deuxième objectif consiste en l’étude structurale de l’interaction de la viperin avec la mitochondrial trifunctional protein (TFP) qui est exploitée par le cytomégalovirus humain pour lui permettre de prendre le contrôle de la surproduction de lipides et ainsi augmenter sa capacité à bourgeonner. Mon troisième objectif consistera à complémenter le travail structural décrit dans les objectifs 1 et 2 par des études fonctionnelles de biologie cellulaire qui permettront d’élucider le rôle de la viperin au cours des infections par le virus influenza et le cytomégalovirus humain.
Ce travail permettra d’acquérir des données structurales sur une radical-SAM eucaryote, sur les réactions enzymatiques qu’elle génère ainsi que son rôle dans l’inhibition d’enzymes clefs de la biosynthèse des lipides. L’intégration des résultats structuraux avec la fonction cellulaire de la viperin au cours du bourgeonnement du virus influenza et du cytomégalovirus, nous permettra de mieux comprendre les détails moléculaires de la perturbation de la biosynthèse des lipides au cours de l’infection virale. Ceci contribuera à mieux déchiffrer l’action des facteurs cellulaires de l’immunité innée capable de moduler l’infection virale.

Coordination du projet

Pauline Macheboeuf (Institut de Biologie Structurale)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

IBS Institut de Biologie Structurale

Aide de l'ANR 257 576 euros
Début et durée du projet scientifique : - 42 Mois

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