Développement et application de la spectroscopie de forces à haute vitesse pour la biologie – BioHSFS

Le projet implique un important développent technologique et aborde questions biologiques pertinentes. Le projet a deux axes:

Objectif 1 : l’application de la spectroscopie de forces à haute vitesse pour mesurer la force de liaison de complexes d’adhésion et le dépliement de protéines
Nous améliorerons la spectroscopie de forces à haute vitesse pour permettre mesurer des interactions entre récepteur et ligand et dépliement de protéines multidomaines de façon automatisée et robuste. Nous appliquerons le système pour caractériser des complexes d’adhésion de leucocytes aux hautes vitesses des vaisseaux précapillaires, mm/s. Cette application nécessitera hardware et software à haute vitesse d’échantillonnage, et nouvelles techniques de bioconjugaison avec protéines de fusion.

Objectif 2 : le développement et l’application de la cartographie de forces à haute vitesse pour des systèmes biologiques.
Nous développerons la cartographie de forces à haute vitesse pour combiner images topographiques et cartographies mécaniques à des vitesses 1000x plus rapides que par AFM conventionnelle. Nous appliquerons la cartographie de forces à haute vitesse sur des membranes pourpre. Cela nous permettra de déterminer comment les propriétés mécaniques de la protéine bactériorhodopsine changent dynamiquement au cours de son photocycle. Comme preuve de concept, nous implémenterons l’imagerie de reconnaissance sur des cristaux 2D de streptavidine en utilisant pointes décorées avec biotine, permettant de localiser les sites de liaison. Cela établira les bases pour la future application sur des cellules.

1. Nous avons développé le système de spectroscopie de forces à haute vitesse permettant une fréquence d’échantillonnage de 50 Méchantillons/s sans problèmes de mémoire et positionnement en XY automatique. Non étant proposé dans le projet original, nos avons utilisé le système pour déterminer la viscoélasticité des cellules vivantes. Le travail résultant a été accepté pour publication à Nature Physics.
2. Nous avons développé un logiciel écrit en Matlab pour l’analyse des donnés des forces de rupture et dépliement travaillant semi automatiquement. Il permet la détection automatique des événements de force et la détermination des paramètres caractéristiques : vitesse de charge, force de rupture/dépliement, distance de rupture… Une partie du logiciel va être écrite en language python pour accélérer l’accès aux données.
3. Toutes les composants nécessaires à la construction du système de détection du mouvement du piezo ont été achetées et le système va être testé sur un banc optique pour la postérieur adaptation au système de spectroscopie de forces à haute vitesse.
4. Nous avons développé une stratégie d’immobilisation de protéines qui permet le couplage covalent via un tag ybbR. La stratégie a été testée avec succès sur une protéine chimérique contenant un tag ybbR, 8 domaines I91 de la titine et un récepteur dockerin III. L’utilisation de pointes d’AFM recouvertes de cohesin III permet l’amélioration en plus de 50-fois de la fréquence d’obtention de bons évènements. Cela fournit une méthode plus fiable, reproductible et robuste pour l’étude du dépliement des protéines. Un manuscrit va être écrit pour expliquer la méthode et son application au dépliement de protéines.

Le système développé a été appliqué à la détermination de la viscoélasticité des cellules vivantes à hautes fréquences, jusqu’aux 100 kHz. Ce régime n’avait pas été exploré antérieurement avec méthodes de microrhéologie active. Nos résultats suggèrent que la réponse viscoélastique des cellules à hautes fréquences nous fournit avec une empreinte plus univoque de l’état de la cellule et son cytosquelette. La comparaison de la réponse de cellules tumorales bénignes et malignes suggère que la méthode peu être un utile de diagnostique ou pronostique dans un futur. Le travail résultant a été accepté pour publication à Nature Physics. Ce développement, ne représente seulement une avance technique remarquable, mais il aussi accélère l’application de la spectroscopie de forces à haute vitesse en cellules vivantes, l’objective à long terme de ce projet.

Le projet original proposait l’application du système pour mesurer la réponse mécanique des complexes d’adhésion cellulaire avec des protéines purifiées. La capacité démontré de travailler en cellules vivantes nous indue à modifié cet objective originale, pour les mesurer directement sur la cellule vivant, et donc, dans son environnement naturel.

Revues à comité de lecture
1. Rigato A, A Miyagi, S Scheuring, and F Rico*. High-frequency microrheology reveals cytoskeleton dynamics in living cells. (Accepted in Nature Physics)

Ouvrages ou chapitres d’ouvrage
1. Sumbul F and F Rico. Single-Molecule Force Spectroscopy: Experiments, Analysis And Simualtions. (Submitted to Methods in Molecular Biology)

Communications (conférence)
1. January, 2017 / Single Molecule Biophysics Meeting, Aspen, CO, USA
2. March 2016 / MechanoBiology Meeting, Amsterdam, Netherlands
3. February 2016 / Biophysical Society Meeting, Los Angeles, CA, USA
4. October 2016 / PhysBio 2016, Orsay

La mécanique des systèmes biologiques est essentielle pour leur fonction. A l’échele de protéines, les changements de conformation dans la microseconde exigent flexibilité des structures secondaires. Au niveau cellulaire, la mécanique du cytosquelette, des molécules d’adhésion et de la membrane plasmatique permet la stabilité structurale. Par conséquent, l’étude de la mécanique des protéines et des complexes protéiques est importante pour notre compréhension des processus biologiques. Les nanotechnologies ont ouvert le champ d’étude de la mécanique des biomolécules individuelles. La microscopie à force atomique (AFM) combine mesures de force et images avec une sensibilité du piconewton et une résolution nanométrique. Néanmoins, la résolution temporelle des mesures de force demeure limitée à la milliseconde et les images exigent quelques minutes d’acquisition. L’AFM à haute vitesse a accéléré de 1000x l’acquisition d’images topographiques. Récemment, nous avons développé la cartographie de forces à résolution submoléculaire ainsi que la spectroscopie de forces à haute vitesse (HS-FS), qui permet des mesures de force sur protéines uniques à des vitesses du mm/s et avec une résolution temporelle de l’ordre de la µs. L’objectif de ce projet est le développement et l’application de la spectroscopie de forces à haute vitesse pour mesurer la mécanique de systèmes biologiques. Le projet implique un important développent technologique et aborde questions biologiques pertinentes. Le projet a deux axes:

Objectif 1 : l’application de la spectroscopie de forces à haute vitesse pour mesurer la force de liaison de complexes d’adhésion et le dépliement de protéines
Nous améliorerons la spectroscopie de forces à haute vitesse pour permettre mesurer des interactions entre récepteur et ligand et dépliement de protéines multidomaines de façon automatisée et robuste. Nous appliquerons le système pour caractériser des complexes d’adhésion de leucocytes aux hautes vitesses des vaisseaux précapillaires, mm/s. Cette application nécessitera hardware et software à haute vitesse d’échantillonnage, et nouvelles techniques de bioconjugaison avec protéines de fusion.

Objectif 2 : le développement et l’application de la cartographie de forces à haute vitesse pour des systèmes biologiques.
Nous développerons la cartographie de forces à haute vitesse pour combiner images topographiques et cartographies mécaniques à des vitesses 1000x plus rapides que par AFM conventionnelle. Nous appliquerons la cartographie de forces à haute vitesse sur des membranes pourpre. Cela nous permettra de déterminer comment les propriétés mécaniques de la protéine bactériorhodopsine changent dynamiquement au cours de son photocycle. Comme preuve de concept, nous implémenterons l’imagerie de reconnaissance sur des cristaux 2D de streptavidine en utilisant pointes décorées avec biotine, permettant de localiser les sites de liaison. Cela établira les bases pour la future application sur des cellules.

Dr. Rico a une forte expérience en cartographie de forces, a développé le premier système de spectroscopie de forces à haute vitesse et a déjà travaillé avec les systèmes biologiques proposés. Son expérience assure donc la faisabilité du projet. Ce projet fera progresser les mesures de force à haute vitesse vers son application finale : la cellule vivante. La consolidation de cette technique permettra explorer de nouveaux régimes dynamiques de la mécanique des biomolécules. La cartographie de forces à haute vitesse ouvre la porte à l’étude des changements dynamiques de la mécanique des protéines, des membranes et des cellules. Les résultats attendus sont technologiquement et scientifiquement pertinents et pourraient conduire à des brevets industriels. Les résultats seront publiés dans des journaux interdisciplinaires et spécialisés. Enfin, ce projet permettra au demandeur de complémenter le laboratoire d’accueil avec une nouvelle ligne de recherche.