Nanohybrides multi-luminescents à scintillation contrôlée pour la microscopie en super résolution, et le suivi de particule unique – BLINK

Une approche innovante pour la synthèse de UCNP ultra petites est actuellement développée faisant appel au chauffage diélectrique grâce à l’utilisation d’un four microonde. Le colorant photochrome choisi (spiropyrane SP) appartient à la catégorie des photochromes négatifs thermiques, étant colorés (volet ON) à l’obscurité et décolorés à la lumière (volet OFF). Tandis que le processus ON-à-OFF nécessite de la lumière, la réaction de retour est spontanée, restaurant l’état OFF. Le polymère retenu est capable de se lier de façon électrostatique à la surface de l’UCNP. La compréhension des flots d’énergie dans l’UCNP et aussi vers le colorant est une tâche impliquant des mesures résolues dans le temps. Enfin, l’observation des nanohybrides isolés nécessite un microscope approprié avec une illumination dans le NIR et a dû être construit. Un logiciel d’analyse d’image contenant une forte densité de sources faiblement scintillantes a aussi été développé.

A l’instant présent, le protocole de préparation des US-UCNP est validé, ainsi que le choix du colorant photochrome. En particulier, notre approche nous a permis d’établir la taille minimale pour observer le phénomène d’upconversion au sein d’une UCNP. Les dispositifs d’observation sont aussi opérationnels, et le logiciel d’analyse des images est disponible.

Les prochaines étapes sont maintenant l’observation des nanosondes in cellulo. Les conditions établies en milieu abiotiques seront transposées à des cellules en cultures. Une fois fixées, celle-ci seront observées en champ large sous irradiation dans le NIR. Pour ce qui concerne la préparation des UCNPs, notre partenaire industriel va intégrer la mesure de DLS au four microonde. Des données DLS ont déjà été enregistrées au cours des synthèses et serviront de base pour calibrer l’instrument.

Plusieurs conférences dans des congrès internationaux et 3 publications sur la méthode d'analyse des images.

Le développement de techniques d’imagerie non invasives dérivées de la fluorescence en champ lointain et permettant d’observer des détails cellulaires avec une précision moléculaire est actuellement le sujet d’intenses recherches (prix Nobel 2014). Les retombées attendues vont de la biologie fondamentale à la médecine. Parmi les microscopies de super-résolution, les microscopies de localisation de molécule unique (PALM, STORM…) et la microscopie de fluctuation optique stochastique (SOFI) utilisent le scintillement de sondes fluorescentes pour dépasser la limite de diffraction. Ce scintillement peut être soit intrinsèque à la sonde (cas des Quantum Dots) soit dû à l’appariement avec un photochrome, c'est-à-dire un commutateur moléculaire.
Les particules inorganiques dopées par des lanthanides présentent la particularité de pouvoir émettre un spectre discret jusque dans la partie bleue du spectre visible après avoir été excitées dans le proche infrarouge (upconverting nanoparticle = UCNP). Comme les tissus vivants absorbent peu dans cette zone, ces particules sont particulièrement intéressantes pour des applications biologiques. En particulier, puisque les émissions de plus hautes énergies peuvent opérer la commutation du photochrome, les UCNPs qui sont naturellement peu scintillantes, peuvent le devenir lorsqu’elles sont couplées à ce dernier. Ainsi, la luminescence stable des UCNPs (dans le très proche IR) peut être utilisée de façon conventionnelle pour le suivi de particule unique, et la luminescence scintillante (dans le visible) pour la super-résolution. Le défi technologique relevé par le projet BLINK porte précisément sur la modulation de la durée de vie de la luminescence à haute énergie de nanoparticules UCNPs par le biais de commutateur moléculaire greffés à leur surface. Ces particules hybrides (nanohybrides) pourront être utilisées simultanément pour le suivi de particule unique, et en super-résolution.
Deux situations sont envisagées:
a) Le scintillement est obtenu en pilotant la commutation du photochrome par deux irradiations externes spécifiques du colorant.
b) La commutation du colorant est sensibilisée de façon « interne », par l’émission à haute énergie de la nanoparticule elle-même via un mécanisme RET. La commutation « retour » est spontanée, par relaxation thermique du colorant.
Les nanohybrides scintillants sont constitués de deux éléments : les UCNPs et le polymère photochrome. Le polymère photochrome sera synthétisé selon un protocole déjà bien établi en greffant des photochromes T et négatifs, de la famille des spiropyranes sur un polymère capable d’encapsuler les nanoparticules et de les stabiliser. Pour les UCNPs, nous utiliserons dans un premier temps des nanoparticules commerciales. Puis, pour un meilleur contrôle des temps de vie -donc de la dynamique du scintillement- nous allons synthétiser des UCNPs à façon. Pour cela, nous nous proposerons une méthode originale de synthèse micro-ondes, en développant le suivi in-situ de l’évolution du mélange réactionnel par diffusion dynamique de la lumière (DLS), en partenariat avec la compagnie Anton-Paar France. L’optimisation de la fluorescence et des temps de vie guidera la sélection des UCNPs. Le comportement des particules individuelles sera évalué sur particule unique en microscopies de fluorescence confocale et de champ large afin d’extraire les propriétés photophysiques (temps de vie, brillance) et les dynamiques de scintillement. Enfin, les nanohybrides seront évalués en microscopie de fluorescence super-résolue sur des cellules de type HeLa.
Les principaux résultats attendus, au delà de la compréhension de l’interaction entre les UCNPs et les photochromes, sont (i) la conception de nouvelles nanoparticules scintillantes pour la microscopie en super-résolution couplée au tracking ; ainsi que (ii) la conception d’un nouvel instrument de laboratoire, un four à micro-onde équipé d’une sonde DLS destiné à la synthèse de nanoparticules.