Traceurs de génotoxicité et traceurs biologiques pour un essai micronoyau en cellules vivantes – GENOTRACE

Le développement de l’essai MN intègre différentes technologies. (i) De petits anticorps reconnaissant la chromatine sont utilisés comme biotraceur de génotoxicité. En effet, exprimés dans les cellules avec une étiquette fluorescente, ils permettent de visualiser la chromatine, et donc les chromosomes, dans les cellules vivantes et en temps réel. Après insertion de ce biotraceur dans les cellules hépatiques métaboliquement compétentes (ii), l’essai MN a été adapté en plaque 96-­--puits pour de l’évaluation à moyen débit (iii). Des protocoles d’imagerie à haut contenu informatif associés à l’utilisation d’outils d’analyse d''image ont également été mis en oeuvre (iv). Ainsi ce projet tend à la caractérisation, in vitro et en temps réel, du potentiel génotoxique des substances/contaminants. Il renseigne sur les processus induisant l’instabilité génétique (composés clastogènes et/ou aneugènes) et pourra être utilisé dans la prévention et le diagnostic d’exposition à des génotoxiques, afin de protéger notre environnement et notre santé

Le biotraceur de génotoxicité a été inséré dans les cellules hépatiques métaboliquement compétentes. Après traitement avec différents composés génotoxiques de référence, nous observons la présence de micronoyaux avec un effet dose-­--réponse. Après traitement avec l’Aflatoxine B1, dont le pouvoir génotoxique dépend de la métabolisation cellulaire, nous obtenons également un essai micronoyau positif, démontrant les capacités métaboliques des cellules utilisées. Après un marquage des centromères, le mécanisme clastogène et/ou aneugène de formation des micronoyaux peut être analysé (voir illustration)

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Le brevet (N° 13 55941) concernant le biotraceur de génotoxicité, publié en décembre 2014, a été étendu à l’international en janvier 2016. Les partenaires 1 et 2 ont également publié un article scientifique présentant cet outil (Jullien et al. 2016). Une publication concernant l’essai micronoyau et regroupant les trois partenaires est en préparation et sera prochainement soumise (fin 2018). Ces travaux ont également été présentés, sous forme de posters, lors de différents congrès internationaux.

Parmi les essais permettant d’évaluer à court terme la mutagénicité, la génotoxicité ou la carcinogénicité de composés chimiques, le test du micronoyau (MN) est largement reconnu comme une méthode fiable et précise pour détecter les lésions chromosomiques. Le test MN est en effet un critère d’évaluation multiple de la génotoxicité, permettant d’étudier des effets clastogènes et aneugènes. Cet essai se prête à l'automatisation et permet une bonne extrapolation des limites d'exposition, avec une mesure facile à la fois in vitro et dans les systèmes expérimentaux in vivo. Toutefois, dans sa configuration actuelle, le test MN ne permet pas une évaluation dynamique. Nous proposons d'apporter des innovations technologiques importantes pour élaborer un nouveau test MN in vitro destiné à l’évaluation des dangers et des risques potentiels liés aux substances mutagène/cancérogènes.
Le consortium public/privé GENOTRACE propose de développer un nouveau test MN permettant de suivre à la fois en temps réel et en parallèle, la production de lésions chromosomiques et le signal d'un rapporteur de génotoxicité. Pour atteindre cet objectif, le projet reposera sur l’utilisation de biotraceurs fluorescents nouvellement développés par les partenaires 1 et 2. Ces biotraceurs permettent de marquer le noyau, grâce à l’expression d’un chromobody dirigé contre le complexe histone H2A-H2B, laissant suivre la dynamique de la chromatine en temps réel, et d’évaluer l’activation de la voie des dommages à l'ADN (DDR pour DNA damage response) grâce à un gène rapporteur sous la dépendance du promoteur du gène p21. Ainsi, un test MN positif associé soit à un signal DDR positif soit à un signal DDR négatif fournira des indications sur l'origine des micronoyaux, induits respectivement par des mécanismes clastogènes ou aneugènes. Afin de prendre en compte le métabolisme de certains composés, ces biotraceurs seront exprimés de manière stable dans les cellules HepaRG, métaboliquement actives, optimisées pour le test MN par le partenaire 3. Ce nouvel essai MN sera adapté au moyen ou haut-débit, et les résultats obtenus seront aisément exploitables grâce à la mise en œuvre de protocoles à haut contenu informatif, l’utilisation d’outils d’analyse d'image et enfin de processus de classification. Notre projet permettra ainsi, in vitro et en temps réel, de déterminer et classer le potentiel génotoxique des substances/contaminants. Il apportera de nouvelles capacités au test MN classique et pourra conduire à des progrès substantiels dans les champs de la prévention et/ou du diagnostic de l'exposition aux substances génotoxiques.