Etude d'une nouvelle cible thérapeutique anti-fongique potentielle: structure, fonction et inhibition des bromodomaines BET fongiques – FungiBET

Notre programme scientifique combine des approches en génétique de la levure, biologie moléculaire, biochimie, biologie structurale et chimie organique de synthèse. Des mutants de levure permettent d’étudier l'importance des bromodomaines de Bdf1 pour la croissance de Candida et sa virulence dans un modèle murin de candidose invasive. Les bromodomaines de Bdf1 sont produits in vitro et purifiés pour déterminer leur structure atomique par cristallographie aux rayons X, seuls ou en complexe avec des inhibiteurs. Des chimiothèques de composés organiques sont criblées à haut débit afin d’identifier des inhibiteurs spécifiques des bromodomaines. Les meilleures molécules sont caractérisées individuellement avec différents essais biochimiques et biophysiques. Enfin, nous utilisons des méthodes de chimie organique afin de synthétiser des analogues des inhibiteurs identifiés, dans le but de développer des molécules inhibitrices plus puissantes et sélectives.

Nos principaux résultats sont les suivants:
(1) Nous avons généré des souches mutantes de C. albicans sans Bdf1 ou exprimant des versions mutées de ses bromodomaines (BD). Cette approche génétique a démontré que la fonctionnalité des BD de Bdf1 est essentielle pour la viabilité de C. albicans in vitro.
(2) Une collection de souches mutantes pour Bdf1 utilisable pour des expériences d'infection invasive chez la souris a été créé et utilisée in vivo. Ainsi, la fonctionnalité des BD de Bdf1 est nécessaire pour la virulence dans un modèle murin de candidose invasive.
(3) Un essai de type HTRF a permis de démontrer que les BD de Bdf1 sont résistants aux inhibiteurs BET humains. Ainsi, les différences structurelles dans les poches de liaison entre Bdf1 et les protéines BET humaines sont suffisantes pour avoir des molécules sélectives.
(4) Une chimiothèque de 80.000 composés a été criblée, permettant d'identifier de petites molécules qui inhibent Bdf1 BD1 ou BD2 avec une affinité de l'ordre du micromolaire et une sélectivité de 25 à 50 supérieure aux bromodomaines BET humains.
(5) Nous avons déterminé les structures cristallines à haute résolution de ces composés liées à leurs cibles BD de Bdf1 et révélé les bases stéréochimiques de la sélectivité de ces inhibiteurs.
(6) Nous avons identifié un composé de dibenzothiazépinone qui reproduit le phénotype induit par la mutation d’un BD de Bdf1 sur la croissance de C. albicans. Ceci démontre que Bdf1 est sensible à l'inhibition de petites molécules dans les cellules fongiques. Globalement, ce travail a établi la preuve de concept que Bdf1 est une cible antifongique prometteuse chez C. albicans qui peut être inhibée sélectivement sans antagoniser la fonction des protéines BET humaines. Ces travaux sont décrits dans une publication récente (Mietton et al., Nature Comm. 2017; PMID: 28516956).
Nos efforts actuels se concentrent sur la validation de Bdf1 comme cible antifongique dans C. glabrata.

À l'aide de souches mutantes de C. albicans, nous avons démontré que les bromodomaines de Bdf1 sont une cible thérapeutique valide pour développer de nouveaux traitements anti-fongiques. De plus, nous avons identifié des composés chimiques qui inhibent sélectivement les bromodomains de Bdf1 en minimisant leur effet secondaire sur les bromodomaines humains. Ces résultats ouvrent la perspective de développement de nouveaux traitements antifongiques utilisant l’inhibition des bromodomaines de Bdf1.

1. Garnaud C, Champleboux M, Maubon D, Cornet M, Govin J. (2016) Histone Deacetylases and Their Inhibition in Candida Species. Front Microbiol 7:1238.

2. Ferri E, Petosa C, McKenna CE. (2016) Bromodomains: structure, function and pharmacology of inhibition. Biochem Pharmacol 106 :1-18.

3. Mietton F, Ferri E, Champleboux M, Zala N, Maubon D, Zhou Y, Harbut M, Spittler D, Garnaud C, Chauvel M, d’Enfert C, Kashemirov BA, Hull M, Cornet M, McKenna CE, Govin J, Petosa C. (2017) Selective BET bromodomain inhibition as an antifungal therapeutic strategy. Nature Comm., 8:15482

4. Selective bromodomain inhibition of fungal Bdf1. U.S. provisional patent application No. 62/366973 filed on July 26, 2016.

Hypothèse. L'hypothèse principale de ce projet est que la protéine fongique Bdf1 peut être une cible thérapeutique dans la lutte contre les infections fongiques invasives. Cette étude sera appliquée aux espèces Candida albicans et Candida glabrata, les deux levures pathogènes les plus fréquentes chez l'homme.

Pertinence médicale: Les infections fongiques invasives sont une cause majeure de morbidité et de mortalité, avec plus de 800 000 décès par an dans le monde. Les espèces C. albicans et C. glabrata sont les pathogènes les plus souvent incriminés dans les infections nosocomiales fongiques. Actuellement, seuls quatre classes de médicaments sont disponibles pour traiter les candidémies. Ces médicaments agissent en ciblant la paroi cellulaire fongique ou la membrane cellulaire, ou en inhibant la synthèse d'acide nucléique. Le nombre limité de traitements anti-fongiques, le coût élevé et la toxicité des médicaments disponibles et l’augmentation des souches résistantes rendent indispensables le développement de nouveaux agents thérapeutiques.

Rationnel: Ce projet consiste à étudier une nouvelle stratégie thérapeutique antifongique en se basant sur l’utilisation de composés anti-cancéreux qui ciblent une famille spécifique de régulateurs de transcription: les protéines BET. Ces protéines lient la chromatine par leurs deux bromodomaines (BD1 et BD2) qui reconnaissent spécifiquement les histones acétylés. La découverte récente d’inhibiteurs de bromodomaines BET humains a permis d’établir que ces protéines sont des nouvelles cibles thérapeutiques anti-cancereuses. Des études réalisés sur S. cerevisiae et C. albicans suggèrent aussi que la protéine BET fongique, Bdf1, est une nouvelle cible pour des médicaments antifongiques.

Résultats préliminaires: Nous avons déterminé les structures cristallines de BD1 et de BD2 de Bdf1 pour S. cerevisiae et C. albicans. Ces structures révèlent que les sites de fixation de ligands acetylés diffèrent de ceux des protéines BET humaines, suggèrant la possibilité d'identifier une petite molécule inhibitrice sélective pour les bromodomaines fongiques. Nous avons développé un test basé sur la technologie FRET permettant le criblage à haut débit de chimiothèques afin d’identifier des inhibiteurs des bromodomaines de Bdf1. En parallèle, nous avons initié un travail de criblage in silico qui a déjà permis d’identifier un potentiel inhibiteur de Bdf1(BD2) de C. albicans.

Objectifs: Le but à long terme de ce projet est de vérifier si l'inhibition des bromodomaines Bdf1 de la levure peut être une stratégie thérapeutique anti-fongique. Les objectifs spécifiques sont les suivants: (i) caractériser sur le plan fonctionnel et structurel les protéines Bdf1 de C. albicans et C. glabrata ; (ii) valider Bdf1 en tant que cible thérapeutique anti-fongique; (iii) développer des composés chimiques inhibant sélectivement les bromodomaines de Bdf1 et démontrer leur potentiel comme nouvels agents thérapeutiques dans les infections fongiques.

Consortium: Ce travail est une collaboration entre des équipes de recherche de Grenoble et Los Angeles. Ce projet de recherche translationnel combine de l'expertise en biologie structurale, en génétique et épigénétique de la levure, en mycologie médicale, et en chimie organique et médicinale.

Résultats attendus: Ces travaux permettront d’améliorer nos connaissances sur la fonction de Bdf1, de trouver des inhibiteurs sélectifs des bromodomaines Bdf1 et de valider la stratégie d’inhibition de Bdf1 comme une possible nouvelle voie thérapeutique dans la lutte contre les infections fongiques. Ce projet est susceptible de générer des brevets, des transferts de technologie vers l'industrie, et de contribuer au développement de nouvelles molécules thérapeutiques à tester en essai clinique de phase I.