Génétique et Physiopathologie des anomalies morphologiques du flagelle spermatique associé à une infertilité masculine. – MAS Flagella

Nous allons utiliser les 5 méthodes et techniques décrites dans les 5 taches décrites ci-dessous pour identifier et caractériser de nouveaux gènes impliqués dans le phénotype MMAF.

Tache 1: Séquençage exomique de 150 patients MMAF
Tache 2 : Identificatino de gènes candidats par l’analyse bioinformatique des résultats du séquençage exomique.
Tache 3 : Caractérisation phénotypique des anomalies spermatiques de patients par immunofluorescence et microscopie électronique.
Tache 4 : Validation et caractérisation de la fonction protéique des gènes candidats grâce au modèle Trypanosoma brucei (T. brucei) qui est doté d’un flagelle similaire au flagelle spermatique avec un axonème avec une structure de 9 + 2 doublets de microtubules.
Tache 5 : Validation et caractérisation de la fonction protéique des gènes candidats grâce à la production par la technique de CRISPR/cas9 de souris KO et à l’étude physiopathologique des modèles obtenus.

Nous sommes convaincus que ce travail nous permettra d’identifier au moins 15 nouveaux gènes liés à une pathologie humaine et que nous pourrons caractériser au moins 5 d’entre eux.

Nous pensons que ce travail permettra d’obtenir un diagnostic génétique pour au moins 60% des patients analyses. Ce diagnostic permettra d’améliorer leur prise en charge thérapeutique.

Nous pensons que ce travail permettra la publication d’au moins 3 manuscrits majeurs (IF>10) et au moins 5 autres dans de bons journaux (IF entre 3 et 8).

L’infertilité masculine concerne plus de 20 millions de personnes dans le monde et représente un problème de santé publique majeur. Nous avons démontré précédemment que des mutations dans les gènes AURKC et DPY19L2 étaient responsables de plus de 70% des cas de macrozoospermie et de globozoospermie, confirmant l’importance des facteurs génétiques dans l’infertilité.

L’asthénozoospermie, décrite comme une diminution de la mobilité spermatique, est impliquée dans près de 50% des cas d’infertilité et de sous-fertilité masculine. Elle est souvent provoquée par des anomalies morphologiques des flagelles spermatiques. Le flagelle et les cils mobiles que l’on trouve dans de nombreuses cellules partagent une structure centrale commune appelée l’axonème qui est composée d’une paire centrale de microtubules entourée de neuf doublets de microtubules. Les dysfonctionnements au niveau des cils mobiles sont connus de longue date et provoquent des dyskinésies ciliaires primitives (DCP), un groupe de pathologies à transmission généralement autosomique récessive, caractérisées par des atteintes principalement pulmonaires fréquemment associées à un situs invertus. De manière cohérente, ces patients présentent assez fréquemment une asthénozoospermie. Nous avons analysé précédemment une cohorte de 20 sujets présentant une asthénozoospermie causée par des anomalies morphologiques et ultrastructurales des flagelles caractérisées par la présence dans l’éjaculat d’une mosaïque de spermatozoïdes présentant des flagelles absents, courts, enroulés ou de calibre irrégulier, sans autres signes cliniques de DCP associés. Nous avons appelé ce phénotype anomalies morphologiques multiples des flagelles (AMMF). Une étude par cartographie par homozygotie nous a permis de localiser le gène DNAH1, qui code pour une dynéine du flagelle que nous avons retrouvé muté à l’état homozygote chez 7 des 20 patients analysés. Nous avons poursuivi ce travail en analysant la séquence exomique des 13 patients non-mutés et nous avons identifié 5 nouveaux gènes candidats, exprimés principalement dans le testicule et et les cellules ciliées (ciliome). Ce travail préliminaire confirme l’hétérogénéité génétique du syndrome AMMF. Nous voulons maintenant analyser l’exome de 50 patients AMMF. Pour faciliter l’identification de mutations causales nous avons concentré notre recrutement sur des cas familiaux et des patients nés de parents apparentés (consanguinité). Nous pensons que ce travail nous permettra d’identifier 15-25 gènes candidats. Nous continuerons ensuite d’utiliser le séquençage haut débit pour réaliser le séquençage ciblé des gènes candidats identifiés sur une cohorte déjà constituée de 250 patients AMMF supplémentaires. Ce travail permettra d’évaluer la contribution relative de chaque gène dans ce phénotype et d’établir une corrélation génotype/phénotype. Par ailleurs, chaque gène retrouvé muté chez plusieurs patients sera caractérisé fonctionnellement dans plusieurs modèles cellulaires et animaux : Trypanosoma brucei, Chlamydomonas reinhardtii, cellules ciliées RPE1 et modèle murin, permettant ainsi de mieux définir les mécanismes moléculaires régulant l’assemblage et le fonctionnement des cils et des flagelles.

La force de ce projet vient du recrutement des patients (une grande cohorte est déjà disponible), de la qualité de l’équipe de génétique qui a déjà démontré ses compétences en identifiant 3 gènes responsables de syndromes d’infertilité masculine et de l’adhésion de trois équipes spécialistes des différents modèles animaux et cellulaires qui seront utilisés pour caractériser les gènes mutés.