Éclairer la fonction des neurones hubs de l'hippocampe adulte chez la souris éveillée par microscopie à modulation de front d’onde – HOLOHUB

We will address the following specific objectives:
(1) We will develop an optical system for in-vivo light-activation of a single cell or a subpopulation of cells deep inside scattering tissue while reading out network dynamics through calcium imaging. The microscope will combine two-photon (2P) imaging with 2P holographic patterned photoactivation and temporal focusing. Different combinations of opsins and calcium indicators will be tested to individuate the optimal candidate for combined photostimulation and functional imaging.
(2) We will interrogate hub function in vivo in the healthy and epileptic hippocampus based on the a priori assumption that early born GABA neurons are potential hub cells.
(3) We will identify candidate hub cells in vivo by looking for neurons which activation has a significant impact on the activity of many others without any a priori assumption on a possible subtype but only based on the analysis of effective connectivity maps.
This project breaks scientific barriers:
(1) it will demonstrate for the first time the use of patterned 2P optogenetics in vivo with single cell precision.
(2) it will address the novel theory that adult cells are functionally different based on their temporal developmental origin.
(3) it will define the role of developmentally defined GABAergic subpopulations in specific hippocampal physio-pathological functions.
(4) it will address the idea that specific neuronal subsets fulfill a “hub-like” function that endows them with the ability to strongly affect the activity of hundreds of other cells.

We built up an optical system enabling in vivo simultaneous 2P imaging and 2P holographic photostimulation using a amplified fiber laser. The system has been also equipped with electrophysiology.
- We started to discuss the optimal design to duplicate the microscope in Cossart Laboratory. To increase the illumination field in the system for Cossart Laboratory, we tested a new model of SLM (having 4 times more pixels).
-We tested and characterized the biophysical properties of different opsins under 2P illuminations. These include Chronos, ReachR and CoChR.
-We used GCaMP transgenic mice and wild type mice bulk loaded with OGB to test the damage threshold under 2P illumination in vivo using the amplified fiber laser.
-We optimized the injection protocol in the hippocampus for Chr2-mcherry, Chronos TdTomato and GCaMP6.
- We found an efficient protocol to express Chr2-mcherry and GCamP6s in CA1 hippocampus area in order to stimulate and record at the same time the activity of CA1 microcircuits. Precisely we optimized the co-localisation of GCamP6s and ChR2 (quantified using immunohistochemical approaches) and tested their functionality using electrophysiology and 2P imaging in brain slices.
The described experiments in hippocampal preparations have been performed by Thomas Tressard, a Phd student from the Cossart lab (co-directed by R. Cossart and V. Emiliani), who has moved starting from January 2016 to the Emiliani lab for 6 months.

- Test experiments of photostimulation and Ca imaging in vivo at shallow depths (L2/3 in visual cortex)(Emiliani lab)
- Test of combined in vivo photostimulation and Ca imaging in the hippocampus (Emiliani lab)
- Selective expression of opsins in hub neurons identified by their early birthdate.
- Duplication of the optical set up in Marseille

1) E. Ronzitti1, R. Conti, E. Papagiakoumou, D. Tanese, V. Zampini, E. Chaigneau, A.J. Foust, N. Klapoetke, E.S. Boyden and V. Emiliani
Sub-millisecond optogenetic control of neuronal firing with two-photon holographic photoactivation of Chronos, submitted
Here we characterized the biophysical properties of the opsin Chronos under 2P holographic illumination
2) R. Conti1, O. Assayag, V. de Sars, M. Guillon and V. Emiliani
submitted

La plupart des fonctions corticales et des pathologies du système nerveux sont associées à l’activité coordonnée de neurones organisés en réseau. Une approche classique pour appréhender la complexité des réseaux neuronaux est de les dissocier en microcircuits, unités fonctionnelles dont le rôle spécifique peut être révélé par modulation sélective de l’activité des neurones qui les composent. La modulation sélective de l’activité de neurones ciblés s’est révélée être une stratégie expérimentale performante in vitro puisqu’elle a permis la mise en évidence d’une classe fonctionnelle majeure de neurones, les neurones « hubs » dont la fonction est d’orchestrer l’activité neuronale de l’hippocampe en développement par le biais d’une arborisation axonale dense et étendue (Bonifazi et al. Science 2009). Si les neurones « hubs » jouent un rôle central pour le développement de l’hippocampe, on ignore si les mêmes cellules, ou des neurones différents jouent un rôle équivalent de hubs, synchronisant l’activité neuronale en conditions physio-pathologiques dans l’hippocampe adulte. Ce projet propose d’étudier la fonction hub in vivo au sein de l’hippocampe de souris adulte. Notre but ultime est double. D’un point de vue du développement optique, nous souhaitons mettre en place un système permettant de cartographier en microscopie la connectivité effective 3D des réseaux hippocampiques de la souris éveillée avec une résolution cellulaire. Du point de vue de la neurobiologie, nous souhaitons lier les neurones hubs à un comportement mettant en jeu une fonction hippocampique et à contraindre des activités pathologiques en agissant sur des microcircuits dispersés et spécifiques. Dans ce but, notre projet se décline selon trois objectifs. Le premier consistera à mettre en place un système optique permettant la stimulation lumineuse de cellules uniques ou d’assemblées cellulaires ciblées en profondeur au sein d’un milieu dispersif tout en enregistrant la dynamique du réseau par imagerie calcium. Ce microscope combinera l’imagerie 2 photons (2P) avec le contrôle spatio-temporel de l’activité neuronale par photoactivation holographique à 2P et par la technique de focalisation temporelle, une nouvelle technique récemment mise en place dans le laboratoire de V. Emiliani (Lutz et al. Nature Methods 2008, Anselmi et al. PNAS 2011, Papagiakoumou et al. Nature Methods 2010, Nature photonics 2013). Les deux objectifs suivants seront menés en parallèle et nécessiteront la stimulation précise de plusieurs neurones. Le premier interrogera la fonction hub in vivo en conditions physiologiques et dans le cerveau épileptique selon l’hypothèse que les neurones GABAergiques générés tôt au cours de l’embryogenèse sont des candidats potentiels à remplir cette fonction hub, d’après les données récentes du laboratoire de R Cossart (Picardo et al. Neuron 2011). Le second objectif sera d’identifier des neurones hubs fonctionnels, sans a priori, en se basant uniquement sur l’analyse de la connectivité effective de la région CA1 obtenue par la photoactivation systématique des neurones actifs chez la souris éveillée. En résumé, ce projet permettra de relier deux niveaux d’analyse des réseaux corticaux, les niveaux cellulaire et comportemental grâce à l’action combinée de deux laboratoires aux expertises différentes mais complémentaires.