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Domestication de transposases et épigénétique: Impact sur la dynamique des génomes – PIGGYPACK

Domestication de transposases et épigénétique: impact sur la dynamique des génomes

Les transposases assurent la mobilité de leurs transposons d'origine en se fixant spécifiquement sur des séquences inversées répétées présentes à leurs extrémités. Des gènes de transposases domestiquées ont été identifiés dans de nombreux génomes et leur rôle demeure encore énigmatique. Ce projet vise à comprendre le rôle que jouent les transposases domestiquées dans les réarrangements programmés du génome, au travers de l'étude du cilié Paramecium tetraurelia comme système modèle.

Rôle de transposases PiggyBac domestiquées dans l'élimination programmée d'ADN

Les transposases se fixent généralement à des motifs de séquence spécifiques aux extrémités de leur transposon d'origine. Ce projet est centré sur le rôle de transposases domestiquées dans l'élimination programmée d'ADN germinal qui se produit pendant la différenciation du noyau somatique chez le cilié Paramecium tetraurelia. Chez cet organisme, l'assemblage du génome somatique implique l'élimination hétérogène de nombreuses séquences répétées, dont des transposons, et l'excision précise de ~45000 courtes séquences internes, chacune en copie unique (Internal Eliminated Sequences, ou IES). La découverte que PiggyMac (Pgm) est essentielle pour l'excision des IES a été la première démonstration qu'une transposase PiggyBac domestiquée intervenait dans des réarrangements programmés. Cependant, les IES ne sont pas apparentées à des transposons piggyBac et ne possèdent même pas de répétitions terminales inversées qui pourraient être des sites spécifiques de fixation par Pgm. La participation d'ARN non-codants et de modifications épigénétiques de l'histone H3 dans le contrôle de l'excision des IES et l'élimination des transposons, a conduit à proposer l'hypothèse de l'existence d'un contrôle épigénétique des réarrangements chez la paramécie.<br />Le principal objectif de ce projet est l'identification et la caractérisation fonctionnelle des partenaires protéiques interagissant avec Pgm pendant l'élimination d'ADN.<br />Trois principales tâches expérimentales ont été définies: (i) l'analyse fonctionnelle de neuf protéines (Pgm-like ou PgmL) récemment découvertes et apparentées à Pgm; (ii) la caractérisation de partenaires de Pgm à partir d'extraits cellulaires; (iii) l'analyse structurale des domaines riches en cystéine (CR) de Pgm et des PgmLs, par rapport au domaine CR d'une transposase PiggyBac (PB), et l'évaluation de leur interaction spécifique avec des modifications épigénétiques des histones. Une quatrième tâche concerne la gestion et le stockage des données.

L'analyse fonctionnelle des PgmLs et des autres partenaires de Pgm identifiés dans ce travail (ex: Ku70/Ku80) a été réalisée en suivant la capacité de cellules soumises à des RNAi spécifiques à former un nouveau MAC fonctionnel (survie de la descendance sexuelle). L'effet de chaque RNAi sur l'excision des IES ou l'élimination des transposons a été testé par séquençage haut-débit de l'ADN extrait des nouveaux MAC de cellules soumises à l'extinction génique, et analyse bioinformatique quantitative des données. La localisation nucléaire de Pgm et de ses partenaires a été confirmée sur cellules vivantes grâce à des fusions GFP ou par détection immunologique des protéines endogènes ou étiquetées avec des anticorps spécifiques. Les interactions protéine-protéine ont été validées par des expériences de co-précipitation.
Deux stratégies ont été utilisées pour rechercher directement chez la paramécie des protéines interagissant avec Pgm : l'immunoprécipitation de protéines à partir d'extraits nucléaires solubles, grâce à des anticorps anti-Pgm or des techniques de marquage protéique par proximité.
Les structures des domaines CR de PB (utilisée comme référence) et de Pgm ont été déterminées par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN). Un catalogue des modifications d'histone présentes chez la paramécie pendant le développement MAC sera établi par spectrométrie de masse. L'interaction des domaines CR de PB, Pgm et des PgmLs avec l'ADN sera testée par la technique de retard sur gel, Leur interaction avec les histones sera testée sur des puces portant des peptides d'histone différentiellement modifiés, ou grâce à des expériences de co-précipitation et d'immunolocalisation (utilisation d'anticorps spécifiques contre Pgm et des modifications spécifiques des histones de paramécie).

• Chacune des cinq familles de gènes PGML est exprimée spécifiquement pendant le développement MAC. Les protéines PgmL se localisent dans le nouveau MAC au moment de l’excision des IES et interagissent avec Pgm lorsqu’elles sont co-exprimées dans un système hétérologue. Chaque PgmL est essentielle pour que Pgm soit correctement localisée dans les nouveaux MAC, ce qui suggère que Pgm agit dans un complexe multi-moléculaire. Le développement d’un nouvel outil d’analyse des données de séquençage (ParTIES) a facilité la détection des IES et la quantification de l’efficacité et des erreurs d’excision. En absence de PgmL2, 4 et 5, l’excision des IES est bloquée, ce qui suggère que ces PgmLs sont des composants-cœurs du complexe. L’absence de PgmL1 et 3 permet encore une excision partielle, mais avec plus d’erreurs, suggérant que ces deux familles ont un rôle plus accessoire.
• Le domaine CR de la transposase PB forme une structure compacte et fixe deux ions zinc dans un repliement semblable aux motifs RING ou PHD. De manière inattendue, ce domaine fixe l’ADN de manière spécifique au niveau de motifs de séquence présents dans les répétitions terminales inversées du tranposon piggyBac. Un modèle a été proposé pour la structure du complexe CR/ADN, d’après les données de RMN et des simulations d’interactions moléculaires. La structure du domaine CR de Pgm a également été déterminée : il s’agit d’un nouvel arrangement de doigts de zinc, comprenant deux histidines, six cystéines et deux ions Zn2+, très différent du domaine CR de PB.
• L’existence des modifications H3K9me3 et H3K27me3 dans le MAC en développement a été confirmée par spectrométrie de masse sur les histones de paramécie. Des anticorps spécifiques contre Pgm, PmgL2, PgmL5 et les modifications H3K27me3 et H4K20me1 de la paramécie sont maintenant disponibles.
• Un nouveau protocole de purification des MAC en développement a été mis au point, grâce à un tri basé sur la taille, la granularité et leur contenu en ADN.

Les études à venir viseront à déterminer la stoechiométrie et l’organisation de Pgm et des PgmLs dans le complexe associé à Pgm, purifié à partir d’extraits nucléaires de paramécie ou après reconstitution in vitro à l’aide de protéines purifiées. L’activité du complexe pour la fixation à l’ADN ou la coupure des IES sera testée in vitro. Grâce aux anticorps spécifiques disponibles, nous suivrons par immunomarquage la cinétique d’apparition/disparition de chaque composant du complexe, ainsi que des modifications d’histones potentiellement intéressantes, pendant le développement MAC. La colocalisation des signaux sera examinée avec la meilleure résolution possible par microscopie confocale.
La fixation des domaines CR de Pgm et des PgmL sera testée par des expériences d’immunoprécipitation, grâce à l’utilisation de domaines CR étiquetés par la GST et de préparations purifiées d’histones de paramécie. L’interaction avec des modifications intéressantes des histones sera analysée en détail par spectroscopie RMN afin d’identifier les résidus impliqués dans l’interaction. De nouvelles stratégies de purification des domaines CR des PgmL seront explorées pour obtenir des préparations solubles adaptées aux études par RMN.
La recherche des partenaires associés à Pgm in vivo sera poursuivie grâce au développement de nouvelles stratégies expérimentales.

Pendant les 18 premiers mois du projets, le travail collaboratif du consortium PIGGYPACK a fait l’objet de présentations lors de 5 conférences internationales (4 conférences invitées, 2 présentations orales et 1 présentation par affiche) et 4 réunions nationales (1 conférence invitée, 4 présentations orales et 1 présentation par affiche).
Trois articles monopartenaires ont été publiés dans des revues à comité de lecture (2 pour le partenaire 3, 1 pour le partenaire 4) et les partenaires ont chacun présenté leur travail lors de 7 conférences internationales (4 présentations pour le partenaire 1, 1 pour le partenaire 2, 1 pour le partenaire 3, 3 pour le partenaire 4) et 8 réunions nationales (3 présentations pour le partenaire 1, 5 pour le partenaire 4).

Les transposons sont mobilisés par leur transposase, qui reconnaît spécifiquement des séquences en répétition inverse (TIR) aux extrémités du transposon à partir duquel elle est produite, et catalyse des réactions de coupure et de transfert de brins d’ADN. Des transposases domestiquées, qui ne sont plus codées par des éléments mobiles, ont été identifiées dans de nombreux génomes mais leur fonction demeure mal connue. L’exemple le mieux étudié est RAG1, qui initie la recombinaison des gènes d’immunoglobulines dans les lymphocytes, en coupant spécifiquement des séquences d’ADN homologues aux TIR de son transposon ancestral. D’autres exemples de réarrangements génomiques programmés (RGP) ont été décrits chez divers organismes et une hypothèse particulièrement séduisante pourrait être que ces réarrangements soient catalysés par des transposases domestiquées.

La paramécie est un modèle extraordinaire pour étudier le rôle de transposases domestiquées dans les RGP. En effet, cet eucaryote unicellulaire cilié réarrange entièrement son génome somatique à chaque cycle sexuel. La paramécie abrite deux noyaux différents dans son cytoplasme. Le micronoyau diploïde (MIC) renferme le génome germinal transmis à la descendance à chaque cycle sexuel. Le macronoyau somatique (MAC), siège de l’expression des gènes, contient une version réarrangée du génome germinal. A chaque cycle sexuel, le MAC est détruit et un nouveau MAC se développe à partir d’une copie du MIC. Pendant le développement du MAC, deux types de séquences germinales sont éliminées : (i) l’élimination d’ADN répété est associée à la fragmentation des chromosomes, et (ii) environ 45 000 courtes séquences non codantes (IES, Internal Eliminated Sequences) sont excisées de façon précise pour reconstituer les phases ouvertes de lecture. L’excision des IES dépend de cassures double-brin introduites par PiggyMac (Pgm), une transposase domestiquée de la famille PiggyBac.

La participation d’une transposase PiggyBac domestiquée dans les RGP chez la paramécie demeure un mystère, car les IES ne sont pas apparentées à des transposons piggyBac et ne portent pas de TIR reconnaissable de façon séquence-spécifique par Pgm. Notre objectif est de comprendre comment les coupures dépendantes de Pgm sont ciblées au niveau des bornes des IES. Nous savons que des ARN non-codants interviennent dans la comparaison globale des génomes MIC et MAC parentaux et guident les réarrangements dans le nouveau MAC, probablement via le dépôt de marques hétérochromatiniennes. Cependant, l’excision de seulement une partie des IES est soumise à ce contrôle épigénétique. Par ailleurs, nous avons découvert récemment neuf autres transposases domestiquées chez la paramécie, dont certaines, bien qu’apparemment inactives pour la coupure, sont essentielles pour l’excision des IES et interagissent avec Pgm in vitro. Dans ce projet, nous examinerons deux hypothèses non-exclusives qui pourraient expliquer comment Pgm reconnaît toutes les IES et les excise précisément : (i) Pgm pourrait s’associer avec des partenaires pour former différents complexes spécifiques de classes distinctes d’IES ; (ii) Pgm pourrait être guidée vers ses cibles grâce à la reconnaissance de modifications alternatives de la chromatine ou via des ARN « guides » qui restent à identifier.

Notre projet pluridisciplinaire vise à (i) caractériser les partenaires de Pgm ; (ii) disséquer leur rôle dans l’excision des IES par des approches in vivo et in vitro combinées à des analyses génomiques à grande échelle ; et (iii) déterminer les bases structurales de l’interaction du (des) complexe(s) associé(s) à Pgm avec les histones modifiées. Notre réussite reposera sur la formation d’un consortium de quatre équipes possédant des expertises complémentaires en génétique moléculaire et cellulaire de la paramécie, en biochimie, dans l’analyse bioinformatique de données de séquençage à grande échelle et dans l’analyse structurale par RMN des interactions protéine-protéine.



Coordination du projet

Mireille BETERMIER (I2BC)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

IJM Institut Jacques Monod
CNRS - I2BC I2BC
CNRS - ICSN Institut de Chimie des Substances Naturelles
CNRS - I2BC I2BC

Aide de l'ANR 550 000 euros
Début et durée du projet scientifique : septembre 2014 - 48 Mois

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