Révéler les détails conformationnels d’une pompe d’efflux membranaire – BmrA-NMX

Pour répondre à ces questions, nous allons nous concentrer sur le transporteur ABC BmrA bactérienne, qui est structurellement et fonctionnellement proche de l'ABCB1, le P-gp (principalement responsable de la résistance aux médicaments chez les humains38), et étudiera ses conformations et les interactions avec les médicaments à l'aide de la combinaison de la RMN des solides (N), échange H/D couplée à la spectrométrie de masse (M) et la diffraction des rayons X (X). Les partenaires visent à combiner leurs compétences clés de manière concertée afin d'isoler et de caractériser de nouveaux intermédiaires de conformation, afin de dessiner une image plus complète des processus impliqués dans l'exportation de drogues et contraignant.

- Développement de techniques de RMN détection proton
-Développement de méthodes d'empreinte de déplacements chimiques en RMN du dans de grandes protéines multidomaines (en utilisant comme modèle l'hélicase DnaB)
-préparation de l'échantillon de l'étiquette en sens inverse a été créé BmrA réinsérés dans des membranes lipidiques.
-Explorer d'autres techniques de reconstitution des lipides.
GRecon -La protéine a été préparé dans différents états fonctionnels correspondant à l'ouvert, fermé, et les formes liées.
-des analogues de la protéine paramagnétiques ont été préparés.
-Les spectres de la transporter ont été analysés
-différentes formes mutantes ont été créés et testés pour établir l'activité de détection des protons des échantillons afin de prolonger leur affectation ; analyser les données d'Ouvert/ferme/med états liés

Nous avons créé de nouveaux mutants dans la soi-disant 'X-loop' et 'Q' boucle de BmrA fondée sur le spectre RMN suggérant le déplacement chimique très inhabituelle d'un résidu Gln ou Glu (entouré d'une Gly et résidus Arg (séquence G(E)Q/R ou R(E/q)G). Les activités de transport ont été mesurées pour le mutant, et la purification des protéines suggèrent que l'ATPase sont inchangées. Par conséquent ces mutants sont touchés dans le couplage entre les activités de transport et de l'ATPase. Les conditions d'une protéolyse limitée ont été optimisés pour soutenir l'existence d'une conformation différente en présence de médicaments transportés. Ils ont été validés au niveau des fractions membranaires et après reconstitution dans des protéoliposomes. Nous avions mis l'accent sur la cristallisation BmrA, en DN cholate-avec une résolution de 6 A. En 2016, nous avons reproduit l'état et nous sommes en train de tester d'autres détergents, à commencer par remplacer LMNG DDM. Nous sommes à la quantification de ces détergents par une méthode que nous avons mise en place à l'aide de MS MALDI TOF (soumis). De nombreux essais de cristallisation ont été effectuées dans les mésophases lipidiques sur la cristallisation des protéines membranaires à haut débit de l'ISBG à Grenoble. Les tests ont été effectués sur le type sauvage et mutant inactif sur de BmrA dans diverses conditions de concentration et de détergent. Quelques-uns d'entre eux mènent à des objets cristallins qui pourrait être vu sous une lumière UV qui suggère qu'ils sont faits de protéines. Ils ont été testés à l'ESRF sur une ligne de lumière microfoyer mais ne montre aucune X-ray diffraction. Essais d'optimisation sont en cours.

1. T. Wiegand, C. Gardiennet, R. Cadalbert, D. Lacabanne, B. Kunert, L. Terradot, A. Böckmann, and B. H. Meier, “Variability and conservation of structural domains in divide-and-conquer approaches.,” J. Biomol. NMR, pp. 1–8, May 2016.
2. C. Gardiennet, T. Wiegand, A. Bazin, R. Cadalbert, B. Kunert, D. Lacabanne, I. Gutsche, L. Terradot, B. H. Meier, and A. Böckmann, “Solid-state NMR chemical-shift perturbations indicate domain reorientation of the DnaG primase in the primosome of Helicobacter pylori,” J. Biomol. NMR, vol. 64, no. 3, pp. 189–195, Mar. 2016.
3. T. Wiegand, C. Gardiennet, F. Ravotti, A. Bazin, B. Kunert, D. Lacabanne, R. Cadalbert, P. Güntert, L. Terradot, A. Böckmann, and B. H. Meier, “Solid-state NMR sequential assignments of the N-terminal domain of HpDnaB helicase,” Biomol NMR Assign, pp. 1–11, 2015.
4. S. Penzel, A. A. Smith, V. Agarwal, A. Hunkeler, M.-L. Org, A. Samoson, A. Böckmann, M. Ernst, and B. H. Meier, “Protein resonance assignment at MAS frequencies approaching 100 kHz: a quantitative comparison of J-coupling and dipolar-coupling-based transfer methods.,” J. Biomol. NMR, vol. 63, no. 2, pp. 165–186, Oct. 2015.
5. A. Böckmann, M. Ernst, and B. H. Meier, “Spinning proteins, the faster, the better?,” Journal of Magnetic Resonance, vol. 253, no. C, pp. 71–79, Apr. 2015.

Nous chercherons dans ce projet BmrA-NMX à dévoiler les détails structuraux des différents états conformationnels impliqués dans la fixation et l’export de drogue par le transporteur ABC BmrA, utilisant comme techniques la RMN (N), la spectroscopie de masse (M) et la cristallographie à rayons X (X). Ce transporteur bactérien est un modèle de choix pour l’étude du rejet de médicaments, un mécanisme qui joue un rôle essentiel en médecine car il s’opère de l’être humain aux bactéries. Selon l’espèce considérée, ce mécanisme est responsable du rejet d’antiviraux, d’antibiotiques, d’antifongiques, d’antiparasitaires ou d’anticancéreux.
Nous utiliserons des techniques biochimiques de pointe pour identifier et caractériser de manière détaillée les différents états conformationnels de la protéine, en utilisant des formes mutantes ou des conformations particulières en présence de drogues. La fixation de drogues et la capacité de transport seront testées pour les mutants et les conditions seront établies afin d’étudier les différentes drogues transportées, ainsi que les différents conformations impliqués dans cette activité.
Trois approches biophysiques différentes et complémentaires seront utilisées afin de décortiquer les caractéristiques structurales du transporteur : la RMN, la cristallographie aux rayons X et l’échange hydrogène/deutérium couplée à la spectrométrie de masse. Elles permettront d’accéder à des paramètres structuraux complémentaires : la structure 3D globale, les changements conformationnels, la stabilité et l’accessibilité des éléments de structure secondaire. La préparation d ‘échantillon, sous différentes formes, sera établie grâce aux informations recueillies par des études biochimiques, et les protéines dans la forme cristalline, membranaire, avec des drogues fixées ou des protéines mutées seront préparées. Pour la RMN, des formes marquées de manière isotopique seront aussi conçues.
A partir de techniques différentes, notre but est d’obtenir des informations complémentaires et de les combiner afin de dresser un portrait aussi complet que possible du processus de transport de drogues. Les connaissances acquises grâce à ce projet seront un tremplin vers la compréhension de l’ensemble des mécanismes moléculaires permettant le rejet des médicaments.