DS0401 - Une nouvelle représentation du vivant

Nanostructures biologiques et synthétiques étudiées par Résonance Magnétique Nucléaire du Solide – NanoSSNMR

Nanostructures étudiées par RMN du Solide

Les assemblages moléculaires de protéines ou de peptides sont des systèmes présents de façon ubiquitaire dans les processus biologiques. L'assemblage de protéines ou peptides permet la formation de nanostructures: fibrilles, filaments, nanotubes ou pores permettant d'exécuter des fonctions biologiques (transport à travers membranes, sécrétion bactérienne, infection, propagation de prions, etc.). Déterminer l'architecture de ces nanostructures représente un formidable défi technologique.

Architecture de nanostructures complexes

La conception de nouvelles architectures, et particulièrement l'optimisation de leurs propriétés, constitue une tâche formidable qui requiert la compréhension des paramètres thermodynamique et cinétique associés avec le phénomène d'assemblage / désassemblage. Les interactions faibles (van der Waals, Coulomb, interactions hydrophobes, liaisons hydrogènes) sont des facteurs cruciaux dans l'assemblage. Détecter et étudier le réseau d'interactions faibles, et ce à la meilleure résolution spatiale possible, est donc d'un intérêt important en vue de comprendre ces organisations supramoléculaires. Cette tâche est très compliquée à cause de la nature des ces nanostructures, qui forment souvent une matière dite «molle«: peu ou pas de diffraction aux rayons X, ainsi que leurs interactions intermoléculaires, souvent hydrophobes, augmente leur capacité à rapidement s'agréger, ceci rendant difficile leur analyse par des méthodes nécessitant des échantillons solubles, telle que la résonance magnétique nucléaire en solution. L'établissement de modèles tridimensionnels (3D) structuraux nécessite souvent de considérer que les interfaces intermoléculaires observées dans le système assemblé sont équivalente à celles observées dans le «packing« intermoléculaire cristallin, une hypothèse souvent difficile à démontrer. En conséquence, les modèles structuraux 3D de ces nanostructures supramoléculaires sont peu représentés. Il existe un besoin urgent de développer des nouvelles approches permettant de détecter ces interactions faibles et de déterminer la structure à l'échelle atomique de ces organisations supramoléculaires.

Notre méthodologie est basée sur plusieurs approches:

. le développement de stratégies de marquage isotopique, notamment pour la détection non-ambiguë des interactions intermoléculaires (i.e. entre sous-unités).

. des expériences de RMN du Solide pour détecter des contraintes de distance de type internucléaire. Nous développerons notamment les expériences basées sur la détection proton en utilisant des sondes de rotation dites «ultra rapide«.

. La combinaison de données provenant de la RMN du solide et d'autres méthodes de biophysique (diffraction aux rayons X, microscopie électronique), dans le but d'établir des modèles 3D atomique.

- Assemblage et caractérisation par RMN du Solide d'un nouvel agent prion:

Nous avons développé un protocole pour la production et l'assemblage d'un nouvel agent de 63 acides aminés impliqué dans le processus de mort cellulaire programmée. A l'aide de nos méthodes de RMN du Solide, nous avons réussi à caractériser son architecture atomique sous sa forme assemblée en fibres et corréler son aspect structure-fonction à l'aide de mutants. Ces résultats ont été publiés dans le journal Proc. Nat. Acad. Sci. USA (PNAS) en 2016. Les détails techniques du protocole de production / purification / assemblage sont en cours de publication (manuscrit soumis).

- Assemblage et caractérisation par RMN du Solide d'un nouvel agent prion:
Nous avons réalisé la production de plusieurs marquages isotopique afin de mesurer des contraintes de distance pour établir l'architecture à l'échelle atomique de ce prion. Les expériences de RMN du Solide sont en cours.

1. Daskalov et al., PNAS 2016
2. Habenstein et al., Biophys Chem. 2016
3. Habenstein et al., Methods Mol. Biol. Sous presse

Les assemblages moléculaires sont omniprésents dans les cellules vivantes, et jouent des rôles primordiaux dans de nombreux processus biologiques. En effet, de multiples copies de sous-unités protéiques peuvent s'organiser en de grands nanostructures macromoléculaires, en forme de fibrilles, filaments, pores, capsides, etc. Comprendre les mécanismes responsables de l'assemblage moléculaire de ces systèmes est d'un intérêt majeur en biologie afin d'étudier leurs fonctions cruciales. Inspirés par ces formidables architectures, les chimistes supramoléculaires souhaitent élaborer des auto-assemblages synthétiques ayants de nombreuses applications, allant de la médecine régénérative à l'administration de médicaments. Le design de nouvelles nanostructures et le réglage de leurs fonctionnalités nécessitent une description détaillée et une compréhension des interactions faibles guidant le processus d'assemblage moléculaire.

Pour ces nanostructures auto-assemblées impliquées dans des processus cellulaires ou élaborées par la chimie supramoléculaire, la détermination de structures 3D est entravée par plusieurs défis techniques: (i) ces assemblages manquent d'ordre cristallin nécessaire à la cristallographie aux rayons X, (ii) le haut poids moléculaire empêche l'agitation moléculaire, restreignant l'utilisation de la RMN en solution. Jusqu'à maintenant, des approches hybrides combinant des structures à haute résolution des sous-unités isolées et des cartes électroniques de microscopie ont permit de résoudre quelques modèles allant de la basse à la moyenne résolution. Cependant, cette approche ne permet pas la détermination expérimentale des interfaces entre sous-unités, ce qui peut mener à des incertitudes sachant que ces sous-unités peuvent avoir différentes conformations entre leurs états isolés et leurs états pertinents et hautement désirables, c'est à dire assemblés.

Nous avons récemment proposé une nouvelle approche basée sur la spectroscopie de RMN du Solide pour résoudre des nanostructures assemblées (Loquet et al., Nature 2012). Cette percée méthodologique forme la base du projet NanoSSNMR. Nous envisageons maintenant d'étudier des auto-assemblages encore plus complexes, qu'ils soient impliqués dans des processus cellulaires ou synthétiques. Le projet NanoSSNMR exploitera des méthodes de l'état de l'art en RMN du Solide, des marquages isotopiques stratégiques et intégrera des approches hybrides afin d'élucider les mécanismes d'assemblages et de révéler les structures atomiques de deux nanostructures auto-assemblées.

Coordination du projet

Antoine Loquet (Chimie et Biologie des Membranes et des Nanoobjets)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

Université de Bordeaux Chimie et Biologie des Membranes et des Nanoobjets

Aide de l'ANR 299 125 euros
Début et durée du projet scientifique : septembre 2014 - 48 Mois

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