Parallélisation massive de la nanoscopie STED pour étudier l'orchestration spatio-temporelle rapide de protéines dans les sites d'adhésion cellulaire – FastNano

Les cellules adaptent l'organisation de leur cytosquelette et leurs propriétés d’adhésion aux changements biochimiques et physiques de leur environnement. Réciproquement, par adhésion et par génération de forces entre cellules voisines ou par la matrice extra-cellulaire (ECM), les cellules contrôlent leur micro-environnement, leur forme et leur mouvement. Les sites d’adhésion (AS) sensibles à l’intégrine sont les zones de convergence intégrant des signaux biochimiques et biomécaniques provenant de l'environnement extracellulaire de la cellule et de son cytosquelette d'actine. Ainsi, l’assemblage/désassemblage des AS et des réseaux d’actine gouvernent les fonctions cellulaires fondamentales comme l’adhésion, la mécano-transduction, la migration, la croissance, la différentiation et l’apoptose. Toutes ces fonctions sont impliquées dans le développement des tumeurs qui sont toujours associées à un dysfonctionnement des intégrines. La signalisation de celle-ci est accrue dans les cellules cancéreuses et réduite lorsque la rigidité de l’ECM est maintenue, indiquant un lien fonctionnel entre intégrine et certains mécanismes tumoraux. Comme les intégrines et leurs ligands sont liés chacun indépendamment, leurs interactions sont fortement influencées par les contraintes mécaniques. Ainsi la glycocalyx peut influencer l’organisation spatiale des intégrines et leurs fonctions. Il n’a pas été encore démontré si les mécanismes moléculaires d’activation de l’intégrine sont fondamentalement différents dans les cellules cancéreuses.
Aux niveaux moléculaire, sub-cellulaire, et cellulaire, la déformation cellulaire et la migration se font sous forme de cycles allant de quelques secondes à quelques minutes. Durant ces cycles, les protéines se meuvent et subissent des interactions transitoires essentielles à leurs fonctions. Il est donc essentiel de comprendre la réorganisation dynamique e ces protéines à l’échelle nanoscopique ainsi que lien entre les interactions moléculaires et la réponse cellulaire.
La microscopie super-résolue a révolutionné l’imagerie cellulaire puisqu’elles permettent de localiser et suivre des biomolécules uniques sur des échelles nanométriques. La synergie entre nos groupes (Lounis, Giannone) durant ces 4 dernières années a permis le développement de nouvelles stratégies de super-résolutions utilisées pour étudier le comportement spatio-temporel des intégrines et leurs interactions dans les AS matures.
Cependant les techniques de microscopies super-résolues de molécules individuelles sont lentes, et ne permettent pas l’étude de la dynamique rapide (~secondes) de réorganisation des structures macromoléculaires.
Les nanoscopies STED (Stimulated Emission Depletion) / RESOLFT (REversible Saturable OpticaL Fluorescence Transitions) peuvent offrir des résolutions temporelles bien meilleures mais restent cependant des techniques d’imagerie confocale à balayage.
Dans ce projet, nous développerons de nouvelles techniques d’imagerie en champ large super-résolues et rapides basées sur une parallélisation massive du STED /RESOLFT. Celle-ci se fera par l'utilisation de réseaux optiques bien choisis pour former le motif d’extinction de la fluorescence. Une imagerie nanoscopique rapide à deux couleurs sera également mise au point pour étudier les interactions entre protéines. Nous développerons une technique de cartographie rapide de champ de forces à l'échelle nanométrique dans les AS. Nous combinerons aussi cette nanoscopie rapide avec les méthodes de suivi de protéines individuelles pour comprendre comment la dynamique des protéines contrôle l’évolution des sites d’adhésion. Plus spécifiquement, notre but sera : de comprendre les mécanismes sous-jacents à la formation, la stabilisation, et le désassemblage de jeunes AS ; de révéler la dynamique des interactions dans les AS qui produisent la mécano-transduction ; et enfin comprendre comment les glycocalyx extracellulaires favorisent la formation des AS dans les cellules cancéreuses.