Pili de type IV et pseudopili: structure, dynamique, assemblage et fonction moléculaire – FiberSpace

Les pseudopili du système de sécrétion de type 2 et pili de type 4 sont des filaments stabilisés par des liaisons faibles, flexibles et non-covalents. Ils sont ancrés dans la membrane et dynamiques, en état d'assemblage ou (dans le cas des pili de type 4) désassemblage permanents. Afin de déterminer leur structure et comprendre les bases moléculaires de leur assemblage dynamique et fonction, nous avons adopté une approche intégrative et pluridisciplinaire. Grâce aux compétences complémentaires des partenaires, nous menons en parallèle et en synergie des études du système biologique in vivo, in vitro et in silico. La capacité de bactéries et des leur mutants a assembler des fibres est étudiée par l'équipe du Partenaire 1 (Francetic), par des méthodes de fractionnement et par microscopie à florescence. Les analyses du complexe d'assemblage et les interactions protéine-protéine dans la membrane sont effectuées par le pontage chimique ou disulfure, co-purification, et le double hybride bactérien (P1). Partenaire 2 (Nilges) a développé des méthodes de modélisation structurale permettant à d'intégrer les données de distance (obtenues par RMN, pontage chimique, mutagenèse dirigée, etc.) et de modéliser la structure des protéines ou leurs complexes ou polymères. L'expertise du Partenaire 3 (Izadi-Pruneyre) en l'analyse structurale par RMN est indispensable pour déterminer la structure des sous-unités des pili et su complexe d'assemblage. RMN permet également des études des changements conformationnels et des interactions en solution et en temps réel. Enfin, la cryoME est une méthode essentielle pour déterminer la structure des polymères biologiques et Partenaire 4 (Egelman) est expert en analyse des fibres par cette méthode. La microscopie électronique à haute résolution et l'analyse de la variabilité structurale des filaments dynamiques sont nécessaire pour la réalisation su projet.

Nos avancées majeures concernent l'analyse de la structure et du mécanisme d'assemblage du pseudopilus SST2 composé par la sous-unité PulG. La structure de PulG a été déterminé par RMN et P3 a montré la présence du calcium dans la protéine. Nous avons montré que le calcium est essentiel pour la biogenèse du pseudopilus et pour sa stabilité in vitro et in vivo. La structure du pseudopilus a été déterminée, ainsi qu'à la modélisation de la structure de PulG dans l'enveloppe de la fibre grâce a la reconstruction à <5 Å. A 'exception d'un changement de conformation majeur, le déploiement de la partie central de l'hélice alpha de PulG, la structure valide les interactions clé identifiés auparavant.
Nous avons identifié les facteurs d'assemblage interagissant avec PulG dans la membrane, dont son partenaire majeur PulM. Cette protéine est nécessaire pour l'assemblage du complexe SST2 et pour l'interactions avec PulG jouant un rôle majeur de chaperon. Les résidus de PulG impliqués dans cette interaction avec PulM sont également importants pour ses contacts avec la membrane. Les analyses de biochimie et de dynamique moléculaire montrent le rôle de ces résidus dans le mécanisme qui permet aux pilines, initialement ancrées dans la membrane, de se libérer de cette environnement et s'assembler en fibres. La méthylation des pilines jouerait le même rôle, selon nos résultats.
Enfin, nous avons réussi la reconstruction d'un opérons artificiel nous permettant l'expression contrôlée de la machinerie d'assemblage des PT4 d'EHEC. La structure de la piline PpdD à été déterminée par RMN et les modèles des pili assemblés par la machinerie SST2 générés ab initio. La validation de ces modèles par mutagenèse dirigée a identifié les résidus essentiels pour l'assemblage, ainsi que le rôle important de la machinerie d'assemblage. Les interactions protéine protéine au sein du SST2, mais également du système d'assemblage des PT4 EHEC a été caractérisé par la méthode de double hybride bactérien.

Les travaux ouvrent des nombreuses perspectives notamment concernant le rôle essentiel du calcium dans la biogenèse et la fonction de ces systèmes. La reconstitution de la machinerie d'assemblage de PT4 a permis à observer des différences entre les pili assemblés par le système hétérologue SST2 et ceux produits par le système natif. Des analyses par cryoEM sont nécessaires pour déterminer leurs structures respectives. Ces résultats seront complétés par la modélisation et validation des modèles par mutagenèse dirigée.

Articles originaux et articles de revue publiés:

1. 1H, 15N and 13C resonance assignments and secondary structure of PulG, the major pseudopilin from Klebsiella oxytoca type 2 secretion system. López-Castilla A, Vitorge B, Khoury L, Morellet N, Francetic O, Izadi-Pruneyre N. Biomol NMR Assign. 2017 Mar 3. doi: 10.1007/s12104-017-9738-7. PMID: 28258547
2. Nivaskumar, M., Santos-Moreno, J., Malosse, C., Nadeau, N., Chamot-Rooke, J., Tran Van Nhieu, G. and Francetic, O. (2016) Pseudopilin residue E5 is essential for recruitment by the type 2 secretion system assembly platform. Molecular Microbiology 101(6):924-41.
3. Santos-Moreno J, East A, Guilvout I, Nadeau N, Bond PJ, Tran Van Nhieu G, Francetic O. (2017) Polar N-terminal residues conserved in type 2 secretion pseudopilins determine subunit targeting and membrane extraction steps during fibre assembly. Journal of Molecular Biology, 2017 Jun 2;429(11):1746-1765.
4. Thomassin JL, Santos Moreno J, Guilvout I, Tran Van Nhieu G, Francetic O. (2017) The trans-envelope architecture and function of the type 2 secretion system: new insights raising new questions. Molecular Microbiology May 9. doi: 10.1111/mmi.13704. [Epub ahead of print] Review.
5. Maffei B, Francetic O, Subtil A. (2017) Tracking Proteins Secreted by Bacteria: What's in the Toolbox? Front Cell Infect Microbiol. 2017 May31;7: 221.doi: 10.3389/f cimb.2017. 00221. eCollection 2017.

Les microorganismes transforment leur environnement et la planète en grande partie grâce à leurs capacités à transporter des macromolécules et à assembler des organites permettant motilité et adhérence aux substrats. Chez les bactéries, les pili de type 4 (PT4) et les systèmes de sécrétion de type 2 (SST2) assurent ses fonctions par le même mécanisme, très ancien et répandu dans les trois domaines du vivant. Ses nano-machines membranaires catalysent l'assemblage de filaments aux différents propriétés de surface, longueur et dynamique. L'assemblage et désassemblage de PT4 permet la motilité, l'adhésion, formation du biofilm, sécrétion des protéines, ou transport de l'ADN exogène. Les filaments des SST2, limités à l'espace périplasmique chez les bactéries à Gram négatif, assurent la sécrétion de toxines, hydrolases, cytochromes et d'autres protéines sous forme native repliée à travers la membrane externe.
Des nombreux pathogènes de l'homme (Neisseria, Francisella, Vibrio), d'animaux (Aeromonas, Dichelobacter, Escherichia coli), ou des plantes (Xanthomonas, Dickeya) expriment les PT4 et SST2 comme déterminants majeurs de virulence. Leur fonction majeure dans la biosphère implique la dégradation de biopolymères, ou réduction des métaux tels fer ou manganèse. Ces nano-machines d'un grand intérêt fondamental et médical, font l'objet de nombreuses études génétiques, biochimiques ou structurales. Cependant, le mécanisme de leur assemblage et fonction moléculaire reste très mal compris. Leur nature membranaire et dynamique, ainsi que la complexité des systèmes présentent des obstacles majeurs à leur étude.
Les PT4 et pseudopili sont composés de pilines, petites protéines initialement localisées dans la membrane cytoplasmique. Leurs segments membranaires, très conservés, sont impliqués dans les interactions avec les facteurs d'assemblage, tandis que leurs domaines périplasmiques variables déterminent les propriétés de surface des fibres assemblées. Comprendre ces interactions, les étapes d'assemblage des pili et leur dynamique au niveau moléculaire est indispensable pour comprendre le mécanisme de leurs fonctions et de leur rôle dans le pouvoir pathogène. Ces questions définissent l'objectif global de notre projet, qui implique une étude comparative des deux modèles chez les entérobactéries, le T2SS Pul de Klebsiella oxytoca et le système de PT4 chez d'Escherichia coli entéro-hémorragique (EHEC).
Nos objectifs sont les suivants: 1) Déterminer et valider la structure détaillée du PT4 chez EHEC, comprendre sa dynamique et sa fonction moléculaire. 2) Déterminer la composition et les interactions entre les pilines mineures et majeures du pseudopilus natif d'SST2 et 3) déterminer le mécanisme d'assemblage impliquant les interactions entre pilines et le sous-complexe de la membrane interne d'SST2. Notre objectif méthodologique (4) est de développer des outils de bioinformatique structurale adaptés à l'analyse des complexes dynamiques au sens large.
Notre approche pluridisciplinaire est particulièrement adaptée à l'étude des systèmes dynamiques membranaires. Notre consortium réunit les compétences complémentaires nécessaires à cette étude: des connaissances et analyse génétique, biochimique et fonctionnelle du système biologique (Partenaire 1), modélisation flexible et analyse bio-informatique structurale (Partenaire 2), analyse à haute résolution de protéines, leur dynamique structurale et leurs interactions par RMN (Partenaire 3) et microscopie électronique à haute résolution et l'analyse de la variabilité structurale des filaments dynamiques (Partenaire 4). La collaboration entre nos équipes a déjà abouti à 4 publications de haut niveau. Nombreux résultats préliminaires et avancées méthodologiques récentes garantissent la réussite de cette étude. Les résultats auront un grand impact sur les connaissances fondamentales des nano-machines biologiques, ainsi que des implications pour la virulence bactérienne et la bio-remédiation.