Sondes photostables pour la visualisation de protéines avec une haute résolution temporelle – Tag-light
Notre approche utilise de petites sondes fluorescentes synthétiques pour marquer les protéines. La sélectivité est assurée par la fusion à une étiquette protéique génétiquement encodée qui se lie sélectivement aux molécules fluorescentes. La nature modulaire d'une telle approche permet d'affiner les propriétés de la partie synthétique par ingénierie moléculaire, permettant ainsi de mettre à profit la diversité moléculaire offerte par la chimie moderne pour l'étude de systèmes biologiques complexes. Pour obtenir un contraste d'imagerie élevé, nous avons utilisé des sondes fluorescentes qui ne présentent aucune fluorescence avant que le marquage ne se produise. Ces sondes sont souvent appelées sondes fluorogéniques pour souligner leur capacité à générer de la fluorescence lors de l'interaction avec leur cible. Nos marqueurs fluorescents chémogénétiques sont ainsi composés d'une étiquette protéique codée génétiquement qui forme un complexe fluorescent avec de petits chromophores fluorogéniques organiques (également appelés fluorogènes). Un tel marquage fluorogénique permet une imagerie sélective contrastée même en présence d'un excès de fluorogène libre, ouvrant de grandes perspectives pour l'imagerie dans des échantillons complexes tels que des tissus et des organismes entiers.
Au cours de ce projet, nous avons développé un marqueur fluorescent chémogénétique inductible appelé FAST. FAST est un petit tag protéique qui se lie et active la fluorescence d'analogues d'hydroxybenzylidène rhodanine (HBR). FAST a été développé à partir de la protéine jaune photoactive (PYP). FAST s'est avéré très efficace pour le marquage fluorescent de protéines dans les cellules vivantes et les organismes multi-cellulaires.
Ce marqueur unique a permis le développement de protocoles de marquage innovants et ouvre des perspectives inédites pour relever les défis actuels en imagerie, en particulier pour le multiplexage, la microscopie de super-résolution et la construction de biosenseurs. Le développement de FAST a conduit à la création de la start-up Twinkle Bioscience en charge de son développement commercial.
Ce travail a conduit à 8 publications (5 articles de recherche et 3 articles de synthèse), 1 chapitre de livre et 2 brevets.
Publications
Gautier in Optogenetics, Photochemical and Photobiological Sciences Series (S. Vriz & T. Ozawa Eds), The Royal Society of Chemistry (just accepted).
Li, […], Gautier submitted
Pimenta, […], Jullien, Gautier . Sci. Rep. 7, 12316 (2017).
Li, Tebo, Gautier. Int. J. Mol. Sci. 18, 1473 (2017).
Jullien & Gautier Médecine/Sciences 33 (6-7), 576-578 (2017).
Li, […], Jullien, Gautier Chem. Sci. 8, 5598-5605 (2017).
Li, […], Jullien, Gautier Org. Biomol. Chem. 14, 9253-9261 (2016).
Pamont, […], Jullien, Gautier Proc. Natl. Acad. Sci. USA 113 (3), 497-502 (2016).
Jullien & Gautier Methods Appl. Fluoresc. 3, 042007 (2015).
Patents
Patent 1: Pub. No : WO/2016/001437, International Application No.: PCT/14175837.
Patent 2: Application number : EP17305591.4.
L’imagerie est devenue un outil essentiel en Biologie grâce à des avancées majeures en instrumentation et le développement de nombreuses sondes. La microscopie de fluorescence permet maintenant l’observation dans des cellules vivantes de protéines marquées avec des sondes fluorescentes avec une résolution submicrométrique. Cependant, les méthodes basées sur le marquage covalent (génétique ou chimique) de protéines souffrent d’une résolution temporelle non-optimale, rendant délicate l’étude de processus rapides et transitoires, et d’une faible photostabilité, empêchant l’imagerie de molécules uniques sur de longues périodes. Nous proposons de développer une collection de sondes permettant l’étude de processus rapides et d’imager sur une longue période avec un haut contraste. Notre design est basé sur un tag protéique complexant de manière non covalente une molécule fluorogénique. La complexation conduira à une augmentation de la brillance du fluorogène et altérera ses propriétés chromatiques, permettant un marquage rapide et l’obtention d’un bon contraste. Une grande photostabilité sera obtenue en accordant l’affinité du tag pour le fluorogène afin d’obtenir une dynamique d’échange rapide, conduisant à un remplacement rapide du fluorogène et permettant ainsi de s’affranchir du photoblanchiment.
Coordination du projet
Arnaud Gautier (UMR CNRS ENS UPMC 8640 PASTEUR)
L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.
Partenaire
UMR 8640 PASTEUR UMR CNRS ENS UPMC 8640 PASTEUR
Aide de l'ANR 198 640 euros
Début et durée du projet scientifique :
septembre 2014
- 36 Mois
