Détection et caractérisation multiplexée des pathogènes associés aux syndromes respiratoires – ReSynPlex

Dès qu'un syndrome respiratoire est identifié chez un patient, le clinicien doit caractériser rapidement l'étiologie du syndrome et prendre une décision appropriée. Suite à la prise d'échantillonnage (lavage broncho-alvéolaire ou aspiration bronchique), les acides nucléiques totaux (NA) sont extraits. Une étape de PCR multiplexe est réalisée afin d'amplifier les cibles spécifiques devant être détectées. Il est prévu que 50 sondes seront mises en œuvre par puits. 50 sondes permettre la détection des agents pathogènes respiratoires les plus cliniquement pertinents et pour certains d'entre eux de leurs facteurs de virulence et/ou des traits de résistance des agents anti-infectieux.
Suite à la PCR multiplexe, tous les amplicons d'intérêt sont étiquetés. Le test de détection multiplexe est ensuite réalisé en utilisant la technologie HIFI à l'aide d'un robot pipeteur automatisé. Un format de plaque ELISA personnalisé est utilisé, composé d'un fond translucide revêtu avec 50 oligo-sondes dans chaque puits. L'hybridation sera révélé en utilisant un marqueur enzymatique et un substrat chromogène, qui a été prouvé fiable et robuste. Des spots colorés apparaissent sur le fond de chaque puits, et l'imageur densitométrique intégré (AXOware) recueilleront les données de chaque analyse. Le logiciel va traiter automatiquement les données, détecter les spots et les différents au sein de chaque puits. Les résultats analytiques seront interprétés dans un rapport médical clair et concis qui peut être utilisé directement par les cliniciens. L'ensemble du processus sera construit pour être automatisé. La durée du test complet sera de quatre heures, avec seulement 30 minutes de manipulations pour l'utilisateur.

La première phase du projet a permis de valider la preuve de concept: la combinaison de PCRm et de puces à ADN a permis d'identifier les caractéristiques génétiques spécifiques d'agents pathogènes (bactéries et virus à la fois) et de certains facteurs de résistance sur des échantillons connus.
Notamment les points suivant ont été développés et/ou validés:
- le format principal (plaque 96 puits type ELISA),
- le support du test (TKL adhésif basé sur le brevet détenu par AXO),
- la détection par colorimétrie et de l’automatisation de l’essai,
- la détection multiplexée, par la création de pools composés de plusieurs échantillons de pathogènes connus,
- la possibilité de détecter plusieurs types de caractéristiques: gènes cibles de bactéries et virus, facteurs de résistances
- l'optimisation récente des conditions de PCR nous permet de détecter plus de gènes cibles et d’augmenter la sensibilité d’autres gènes cibles.
- La mise en place du protocole analytique automatisé.

Le produit prévu HIFI Resp est conçu pour s'adapter à l'équipement existant de laboratoire: l'extraction, l'amplification par PCR, la manipulation de liquides automatisé. Les appareils minimum requis seront (i) un thermocycleur et (ii) un imageur de microplaques. Pour des besoins à plus haut-débit, un robot manipulateur de liquide automatisé peut implémenter le processus complet (PCRm, l'hybridation sur biopuces, protocole analytique, lecture et interprétation des résultats). Basé sur le concept de la preuve sur les premiers résultats et, performances de l'essai seront évalués (sélectivité, sensibilité).

Un article scientifique est en préparation, sur la base des premiers résultats, afin de valider la preuve de concept.
Un brevet d'application est envisagé en fonction des prochains résultats.

Les syndromes respiratoires associés aux infections sont des menaces prépondérantes pour la santé humaine. Elles se propagent sans distinction géographiques ou sociales. En France, les infections respiratoires sont la cause de 60% des décès dans la catégorie "maladies transmissibles", (source: OMS ; "la charge de morbidité mondiale 2008 ").
Les syndromes respiratoires se caractérisent par un grand nombre d'agent infectieux (virus et bactéries), ces dernières peuvent notamment devenir nosocomiales suite à leur nombreux contact avec des antibiotiques. Typiquement, au sein d'un hôpital, lorsque le clinicien suspecte qu'un patient est infecté lors d'une phase de réveil postopératoire, un diagnostique clair et rapide est nécessaire afin de prendre les mesures appropriées pour la santé du patient. Dans ce contexte, la tentative du clinicien pour caractériser l'étiologie du syndrome d'un patient est un véritable puzzle, entre le nombre de tests disponibles (identification des agents pathogènes, détection des facteurs de résistance/virulence) et le délai d'exécution de ces tests, qui retardent le diagnostic et accroissent les coûts de soin de chaque patient. Actuellement, la plupart des pathogènes sont identifiés individuellement soit par culture soit par des méthodes de PCR, et la multiplication de ces tests n'est que rarement efficace en terme de temps et de coûts (de 48 h à 7j ; et de 40 € pour chaque bactérie à 130 € pour 13 identifications PCR). Un réel fossé existe entre la multiplicité de l'information requise par le praticien et les outils de diagnostic disponibles. Récemment, les trois technologies clés permettant le diagnostic reposant sur la génétique ont évolué: des systèmes d'extraction d'acide nucléiques automatisés, des méthodes de PCR multiplexées ainsi que des outils automatisées de réalisation d'essai coexistent.
Pour aller au-delà, il est désormais nécessaire de combiner habilement ces systèmes, en considérant les besoins spécifiques des cliniciens afin de créer un outil de diagnostic à la fois simple et complet. Il est envisagé d'améliorer le processus analytique en couplant la PCR multiplex avec une méthode de détection spécifique des séquences (puce a ADN) et en permettant à travers une unique étape de PCR multiplex d'identifier les pathogènes et de caractériser leur facteurs de virulence/résistance. Le projet ReSynPlex vise à développer une plateforme automatisée pour le diagnostic rapide (moins de 4h) et complet (étiologie et résistances) des pathologies liées aux syndromes respiratoires en milieu hospitalier, à prix réduit (moins de 30€).
A travers ce projet, le clinicien aura un accès direct, rapide et clair à la connaissance de l'identité du ou des pathogènes impliqués, et de la présence de gènes conférant des résistances. ReSynPlex produira un outil de diagnostic amélioré qui conduira à une meilleure prise en charge des patients dans le milieu hospitalier, ainsi qu’à la réduction de la propagation des infections et à la diminution des coûts hospitalier. Le patient, le clinicien et le système de santé profiteront des avantages de la plateforme technologique de diagnostic créée grâce au projet ReSynPlex.
Depuis trois années (2010-2013), AXO science a conduit avec succès le programme de recherche HiFi-assays (ANR BiotecS 2010). Le projet ReSynPlex vise ici à développer un produit IVD pour l'identification poussée des agents pathogènes, profitant des recherches menées lors de HiFi-assays. En particulier, la technologie développée et brevetée semble parfaitement adaptée à l'application envisagée ici. Grâce à HiFi-assays un premier produit appliqué au génotypage étendu des groupes sanguins sera mis sur le marché. AXO science et ses partenaires historiques (ICBM et IAB) souhaitent désormais valoriser ces résultats en élargissant le champ d'application de la technologie HIFI. Le savoir-faire et l'expertise développée, ainsi que la propriété intellectuelle déposée sera mise à profit dans le projet ReSynPlex.