Caractérisation moléculaire de remaniements chromosomiques apparemment équilibrés par séquençage haut-débit chez 55 patients atteints de déficience intellectuelle et/ou malformations congénitales – ANI

Le séquençage haut-débit (NGS) permet de déterminer la séquence de millions de molécules d’ADN en parallèle. L’analyse bio-informatique permet de comparer chaque séquence obtenue au génome de référence et ainsi d’en déterminer la position exacte et d’en rechercher les variations éventuelles. Des variations structurales, comme les points de cassure, peuvent ainsi être caractérisées en étudiant la distance et l’orientation des séquences.
Les points de cassure des patients seront déterminés par NGS. Ces résultats seront vérifiés par un séquençage Sanger classique. Une analyse bio-informatique permettra de déterminer les caractéristiques de chaque point de cassure (séquence, éléments répétés, gènes, séquences régulatrices). Pour chaque point de cassure, une étude d’expression sera réalisée pour le gène interrompu par le point de cassure et deux gènes adjacents afin d’étudier les conséquences fonctionnelles.

L’étude des 6 premiers patients montrent que les remaniements sont souvent plus complexes qu’attendus. Un cas de chromothripsis constitutionnel, sous-type de remaniement complexe rare et dont les mécanismes sont encore mal connus a été identifié. Parmi les 7 gènes interrompus, 2 permettent d’expliquer le phénotype de 2 patients. Chez 2 patients, la localisation des points de cassure n’a pas été possible car ils intéressent l’hétérochromatine. Une stratégie d’analyse alternative devra être développée pour ces cas particuliers.

Pour 2 patients, le RCAE interrompt un gène, déjà connu comme pathogène et permettant d’expliquer le phénotype. Ceci montre la pertinence diagnostique de la stratégie. La disruption par un point de cassure n’a été rapportée qu’une seule fois pour chacun de ces gènes, à ce jour.
Un cas de chromothripsis constitutionnel a été identifié, ce qui offre une opportunité de comprendre les mécanismes en jeu dans ces remaniements complexes rares.

Une première étude préliminaire à ce projet a déjà été publiée (Schluth-Bolard et al., J Med Genet, 2013; 50:144-150). Les résultats de la présente étude feront l'objet de publications et de communications à destination de la communauté scientifique, des cliniciens et des patients.

Les remaniements chromosomiques apparemment équilibrés (RCAE) associés à un phénotype anormal sont des évènements rares mais qui posent des difficultés pour le conseil génétique. Ils représentent 6% des translocations réciproques de novo et 9% des inversions de novo. Le phénotype anormal, principalement une déficience intellectuelle et/ou des malformations congénitales (DI/MC), peut être secondaire soit à un déséquilibre génomique cryptique associé, détectable par CGH-array, soit par une interruption de gène par le point de cassure. Cependant, le clonage des points de cassure par des méthodes conventionnelles comme la FISH (Hybridation in situ en fluorescence) ou le Southern blot est long et coûteux, et n’est de ce fait pas réalisé en routine. Or, sans une exploration complète et précise des points de cassure, le conseil génétique dans le cadre des RCAE à phénotype anormal est un véritable défi. Récemment, nous avons montré, ainsi que d’autres équipes, que le séquençage haut-débit (NGS, Next Generation Sequencing) était une méthode rapide et efficace pour caractériser les points de cassure des RCAE au niveau moléculaire.
Le projet ANI (Apparently balanced chromosomal rearrangements Next generation sequencing Intellectual disability) a pour principal objectif de caractériser au niveau moléculaire les points de cassure des RCAE par séquençage haut-débit chez 55 patients atteints de DI/MC. Nous partons de l’hypothèse que le RCAE est responsable du phénotype anormal soit par interruption d’un gène, soit par effet de position, puisqu’un déséquilibre génomique cryptique aura préalablement été exclu par CGH-array.
Le projet ANI s’étend sur une durée de 3 ans et sera conduit par 21 partenaires, incluant 19 laboratoires de cytogénétique hospitaliers français, une équipe de recherche (TIGER) et un centre de biotechnologie cellulaire. Les patients seront recrutés par chaque laboratoire de cytogénétique. Les points de cassure des RCAE seront déterminés par NGS et une première analyse bio-informatique. Ces résultats seront vérifiés par amplification des fragments de jonction par PCR suivi d’un séquençage Sanger classique qui permettra de localiser les points de cassure à la base près. Certains cas complexes seront complétés par une étude en FISH. Une seconde analyse bio-informatique permettra de déterminer les caractéristiques de chaque point de cassure (séquence, éléments répétés, gènes, séquences régulatrices). Enfin, pour chaque point de cassure, une étude d’expression sera réalisée pour le gène interrompu par le point de cassure et deux gènes de part et d’autre du point de cassure. L’ensemble de ces résultats seront compilés avec les données existantes de la littérature et d’autres bases de données pour définir si le RCAE est responsable du phénotype du patient, permettant alors un conseil génétique précis et adapté.
Ce projet identifiera de nouveaux gènes candidats impliqués dans la DI et les anomalies du développement. Il contribuera également au développement et à l’évaluation du NGS en tant que moyen diagnostique pour l’exploration des RCAE associé à une DI/MC. Il permettra également de mieux comprendre les mécanismes et les conséquences fonctionnelles des RCAE, notamment en terme d’effet de position.
En conclusion, le projet ANI permettra d’améliorer la prise en charge et le conseil génétique des patients atteints de DI/MC avec un RCAE. Il contribuera également à la compréhension de la physiopathologie des RCAE et des voies impliquées dans le développement et les fonctions cérébrales, améliorant de façon plus générale les possibilités diagnostiques pour les patients atteints de DI/MC.