Etude de la stabilisation de l’oncogène deltaNp73-alpha par la kinase IKK-beta en utilisant une approche de Biologie Structurale Intégrative – IKKp73

Le projet fait usage d'une variété de méthodes qui sont résumées ci-dessous.

Expression des protéines en forme recombinante. Les protéines sont produites par le système d’expression baculovirus dans des cellules d'insectes, dans le cas de la protéine IKKß, et par des systèmes d’expression bactérienne, dans le cas de Dp73. Le système d’expression « cell-free » sera appliqué, si nécessaire, pour la production d’échantillons marquées pour les analyses par RMN.

Expériences d'interaction. L'interaction entre IKKß et Dp73 est analysée par des expériences de « pulldown » utilisant des protéines purifiées (voir ci-dessous) et de résonance plasmonique de surface (SPR, expériences en cours).

Tests d’activité de la kinase. Des expériences de marquage par 32P in vivo à l’aide d’un anticorps anti phospho-422S Dp73 seront effectuées. Des paramètres cinétiques seront obtenus par des expériences in vitro qui utilisent des protéines recombinantes.

Cristallographie aux rayons-X. La cristallographie aux rayons X est notre méthode de choix pour la résolution de la structure du complexe IKKß/Dp73 à haute resolution.

Spectroscopie RMN. La RMN est une technique polyvalente qui sera utilisé pour (i) evaluer le repliement des protéines; (ii) sonder les changements conformationnels; (iii) détecter les interactions par l’approche « chemical shift perturbation » (CSP); (iv) étudier la dynamique par des expériences de relaxation; (v) étudier les interfaces du complexe par CSP. Cette dernière application nécessite le marquage isotopique des échantillons.

Analyses d’interaction protéine-ADN in vivo. Des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) seront effectuées pour analyser le recrutement du complexe IKKß/Dp73 aux promoteurs des gènes.

Analyses de transcription in vivo. Nous allons transfecter des cellules Saos-2 avec des plasmides codant pour IKKß, Dp73 et p53 et suivre t’expression de la protéine endogène p21 par immunotransfert.

Le plan de recherche initialement prévu est divisé en trois parties. Aujourd’hui nous avons accompli la plupart des objectifs de la partie I et nous sommes en train de travailler sur la partie II.

Production des protéines en forme recombinante.
IKKß. La conception des constructions de IKKß est basée sur les structures 3D récemment publiées d'un grand fragment dimèrique de IKKß (résidus 1-669) comprenant les domaines KD, ULD et SDD. Nous avons exprimé la construction IKKß(1-669) dans les cellules d'insectes en utilisant le système d’expression baculovirus. La fraction soluble de l’IKKß(1-669) a été récupéré et purifié à l’aide d’une colonne Ni-NTA suivie par une étape de gel filtration. La protéine IKKß(1-669) purifiée forme un homodimère en solution (Fig. 1A).
Dp73. Nous avons conçu une série de constructions de Dp73. Chaque construction a été produite en double exemplaire, soit dans la version « wild-type » ou contenant la mutation phospho-mimétique S422E. Les résultats des essais de criblage d’expression ont montré que la totalité des constructions peut être exprimée sous forme soluble seulement en présence de l’étiquette MBP, tandis que les autres etiquettes (His6 et GST) n’ont pas permis l’expression de certaines constructions (Fig. 1B).

Etudes d'interaction
Ensuite, nous avons réalisé des expériences de « pulldown » employant les constructions MBP-Dp73 et l’IKKß(1-669) purifiée. Nous avons observé des interactions pour la plupart des constructions de Dp73, y compris ceux comprenant la mutation S422E (Fig. 1C). Ces résultats montrent que: (i) IKKß et Dp73 établissent des interactions directes et ne nécessitent pas d'autres médiateurs cellulaires pour former un complexe; (ii) le complexe IKKß/Dp73 ne se dissocie pas suite à la phosphorylation de la Ser422 et cela est en accord avec les résultats obtenus par nos collaborateurs.

Travail actuel. En ce moment nous effectuons des expériences SPR pour mieux définir l’interaction IKKß/Dp73 du pont de vue de l’affinité et de la cinétique de liaison.
En outre, nous sommes en train de préparer des échantillons marquées de Dp73 pour l'analyse par RMN avec le but de évaluer le repliement des constructions et de sonder des éventuels changements conformationnels déclenchés par la mutation S422E.

Travail futur. Dans les prochains mois, en collaboration avec R. Accardi et M. Tommasino (CIRC Lyon), nous allons effectuer des tests d'activité pour analyser la spécificité de kinase IKKß vers les différentes constructions de Dp73. L'ensemble des données sur les activités de liaison et de kinase fournira des pistes utiles pour le choix des constructions à utiliser dans les études structurales.
Nous prévoyons de commencer les essais de cristallisation sur le complexe IKKß/Dp73 au cours de l'automne. Si nous obtenons des cristaux qui diffractant de manière significative, nous allons continuer en direction de la détermination de la structure du complexe à haute résolution par la méthode des rayons-X. Dans le cas contraire, nous nous tournerons vers la cartographie des interfaces du complexe par RMN.
Dès que des informations sur les résidus impliqués dans l'interaction IKKß/Dp73 deviennent disponibles, nous allons concevoir des mutants d'interface qui seront analysés par des tests d'activités et des tests fonctionnels. Ces mutants vont servir d'outils pour étudier le rôle de l'interaction IKKß/Dp73 dans la reconnaissance des séquences ADN des promoteurs et, de manière générale, dans la suppression de l’expression génique contrôlée par p53. En outre, les mutants de IKKß seront utilisés pour étudier l’interaction de la kinase avec autres substrats (IkB et p53), ce qui nous permettra d'obtenir une vue plus globale sur la fonction d’IKKß.

Les résultats ici résumés donneront lieu à une publication

La kinase IKK est un régulateur de la réponse inflammatoire, immunitaire et apoptotique, principalement connu pour son rôle dans l'activation du facteur nucléaire kB (NF-kB). Cette kinase est un complexe enzymatique constitué de deux sous-unités catalytiques et une sous-unité régulatrice. Notamment la sous-unités IKKß contribue la majorité de l'activité catalytique impliquée dans l'activation de NF-kB.
Il a été proposé que IKK sert de pont entre l’inflammation et le cancer en agissant au sein de plusieurs voies qui favorisent la tumorigenèse. Une étude récente a montré que IKKß régule la stabilité de l’oncogène deltaNp73-alpha isoforme de p73 et membre de la famille du suppresseur de tumeur p53. Dépourvue du domaine N-terminal de transactivation (TAD), la protéine deltaNp73-alpha exerce des fonctions anti-apoptotiques et favorise la transformation cellulaire en entrant en compétition avec p53 lors de la liaison aux promoteurs des genes régulé par p53. Massimo Tommasino et Rosita Accardi, qui participent à ce projet, ont découvert que la phosphorylation par IKKß sur la Ser422 de deltaNp73-alpha conduit à la stabilisation et l'accumulation nucléaire de deltaNp73-alpha entraînant l'inhibition de l'expression des gènes régulés par p53. Curieusement, l'interaction entre IKKß et deltaNp73-alpha semble être renforcée par la phosphorylation de Ser422.
Le projet proposé vise à caractériser l'interaction de IKKß avec deltaNp73-alpha en utilisant une approche de Biologie Structurale Intégrative, comprenant la cristallographie aux rayons X, la spectroscopie RMN et la résonance plasmonique de surface (SPR) complémentés par divers d'activité in vitro et in vivo ainsi que des études fonctionnelles. Les études structurales fourniront des structures à haute résolution ou des modèles des complexes IKKß/deltaNp73-alpha, qui seront complétés par des données de cinétique de liaison et d'activité. L’ensemble ces données permettra d'élucider les mécanismes qui sont à la base de cette interaction. Par la suite, des mutants spécifiques de IKKß et deltaNp73-alpha seront conçus sur la base des connaissance acquises concernant les mécanismes d'interaction. Ces mutants seront testés dans des essais fonctionnels afin de mieux définir le rôle de l'interaction IKKß/deltaNp73-alpha dans l'accumulation nucléaire de deltaNp73-alpha et l'inhibition de l'expression des gènes régulés par p53.
Des études ont montré une augmentation du taux des protéines de IKKß et deltaNp73-alpha dans de nombreux cancers humains (cancers du sein, de la prostate, du foie, du poumon, de la thyroïde) faisant alors de ces protéines d’importantes cibles thérapeutiques. Nous estimons que ce projet peut mettre en évidence des importants mécanismes de régulation du cancer et par conséquent avoir un impact élevé sur la santé publique.