Nouvelles étapes de la Biologie Synthétique: vers la généralisation des méthodes de transplantation de génome – SYNBIOMOLL

La compréhension des mécanismes gouvernant la transplantation de génomes bactériens est un enjeu scientifique majeur, autant d’un point du vue fondamental, mais aussi afin d’adapter les techniques de BS à de nouvelles espèces bactériennes ayant un potentiel biotechnologique important.
Pour cela, nous allons optimiser la technologie de transplantation au groupe Spiroplasma en utilisant Mcap comme cellule receveuse et les génomes d’espèces de plus en plus éloignées d’un point de vue phylogénétique comme ADN donneur. Ces travaux devraient nous permettre d’évaluer l’importance du degré de parenté entre les génomes donneurs et receveurs et de déterminer la limite de compatibilité du système. Les génomes de l’espèce la plus éloignée encore transplantable dans Mcap, ainsi que celui de l’espèce la plus proche mais non transplantable, seront clonés dans S. cerevisiae et modifiés grâce aux outils génétiques disponibles. Des gènes ou groupe de gènes potentiellement impliqués dans le phénomène de compatibilité (origine de réplication, gènes impliqués dans la transcription…) seront échangés entre ces deux génomes et l’impact de tels échanges sera évalué. Une connaissance approfondie des facteurs génétiques clés impliqués dans le processus de transplantation devrait nous permettre : (i) de transposer ces méthodologies à d’autres espèces bactériennes et (ii) de possiblement créer des cellules receveuses avec des spectres d’hôtes plus larges.
Le transfert de ces techniques de transplantation au groupe Acholeplasma/Phytoplasma sera également tenté. L’organisme modèle A. laidlawii présente des caractéristiques similaires à la plupart des espèces bactériennes d’intérêt biotechnologique majeur. Aidé par nos connaissances issues de l’étude du groupe Spiroplasma, la tolérance d’A. laidlawii en tant que cellule receveuse sera étudié. In fine, sa capacité à répliquer et exprimer des génomes de différentes espèces de phytoplasmes, modifiés et clonés dans la levure, sera également évaluée.

Les premières études ont cherché à évaluer le degré de parenté nécessaire entre des génomes donneurs et la cellule receveuse au cours d’une transplantation de génomes entiers, ainsi qu’à mettre en évidence les facteurs génétiques essentiels à cette compatibilité. Pour se faire, différentes espèces de Mollicutes, plus ou moins éloignés phylogénétiquement de la cellule receveuse (Mcap) ont été transplantés soit à partir de leur génome isolé (transplantation bactérie-bactérie) soit à partir de leur génome cloné dans la levure (transplantation levure-bactérie).
Les résultats obtenus montrent que plus le génome donneur est proche phylogénétiquement de celui de la cellule receveuse, plus l’efficacité de transplantation est élevée, et cela qu’il s’agisse de transplantations réalisées à partir des génomes isolés de Mollicutes ou depuis la levure. Dans ces expériences, une limite de transplantation semble avoir été atteinte. Elle se situerait entre les espèces Mesoplasma florum (obtention de transplants) et Spiroplasma citri (pas de transplants). M. florum est désormais considéré comme le génome compatible le plus distant phylogénétiquement de notre cellule receveuse. Ce partenaire est donc essentiel à la compréhension des mécanismes intervenant dans la prise en charge et la réplication du génome donneur au cours de la transplantation. Des travaux, incluant M. florum et concernant l’importance de l’origine de réplication dans la transplantation, ont déjà été initiés au laboratoire et ont déjà donné des résultats significatifs.
De plus, en parvenant à transplanter avec succès dans Mcap, les génomes clonés dans la levure puis modifiés de Mcap, M. leachii, M. mycoides subsp. capri, M. putrefaciens et M. florum, nous disposons d’un système d’ingénierie de génomes permettant la mutagénèse ciblée de gènes d’intérêts pour chacune de ces espèces. Ceci représente un outil inestimable pour la communauté scientifique travaillant sur chacun de ces organismes modèles.

Tout d’abord, ce projet va placer notre équipe dans une position stratégique puisque la capacité à transplanter des génomes bactériens entiers est un aspect extrêmement prometteur de la BS. Notre laboratoire aura avoir une visibilité internationale dans un domaine qui concentre de grands espoirs pour la conception et la construction de systèmes biologiques avec de forts potentiels en médecine humaine et vétérinaire, dans la protection de l’environnement et production de molécules avec une haute valeur ajoutée.
En plus d’offrir de nombreuses avancées fondamentales sur la compréhension de fonction clés d’une cellule bactérienne (réplication, transcription, caractérisation d’un « génome minimal », etc…), ce projet est également centré sur la compréhension des mécanismes impliqués dans la compatibilité entre les génomes donneurs et la cellule receveuse. Des connaissances approfondies à ce niveau nous permettront d’obtenir de nouvelles paires « génome donneur/cellule receveuse », dont certaines d’entre elles ayant des intérêts académiques ou biotechnologiques majeurs. En particulier, le transfert des méthodes de transplantation de génomes au genre Acholeplasma permettra d’établir cet organisme comme nouvelle plateforme pour l’étude d’autres espèces bactériennes avec des perspectives fortes au niveau économique. Non pathogène et adapté à la transformation génétique, A. laidlawii est un organisme de choix pour démarrer ce type d’expérimentations et le transfert de cette technologie chez cet organisme serait donc une étape clé vers le développement d’applications biotechnologiques majeures. En effet, A. laidlawii possède un métabolisme réduit tout en lui conférant une grande autonomie, compatibilité rare chez des organismes pourvus de génomes réduits. Dès lors, on peut penser que l’addition de nouvelles voies métaboliques d’intérêt biotechnologique ne donnera pas lieu aux perturbations observées chez des organismes plus complexes.

Ce projet, débuté début 2014, nous a déjà permis la publication d’un premier article :
- C. Lartigue, A. Lebaudy, A. Blanchard, B. El Yacoubi, S. Rose, H. Grosjean, and S. Douthwaite. 2014. The flavoprotein Mcap0476 (RlmFO) catalyzes m5U1939 modification in Mycoplasma capricolum 23S rRNA. Nucleic Acids Res. 42 (12) :8073-8082.
Les récents développements concernant (i) l’importance de facteurs génétiques (distance phylogénétique et l’origine de réplication de chromosomes bactériens) entre les génomes donneurs et receveurs et (ii) notre capacité récente à étendre la transplantation de génome à l’organisme modèle Mesoplasma florum en utilisant Mcap comme cellule receveuse devrait permettre la publication de 2 articles supplémentaires dans des journaux de premier plan :
- F. Labroussaa, A. Lebaudy, G. Gourgues, V. Baby, D. Matteau, S. Rodrigue, A. Blanchard, S. Vashee, P. Sirand-Pugnet and C. Lartigue. Extending genome transplantation knowledge within Mollicutes. In preparation.
- F. Labroussaa, V. Baby, G. Gourgues, D. Matteau, C. Lartigue and S. Rodrigue. In-yeast cloning and genome transplantation of modified Mesoplasma organisms. In preparation.

Ce projet et les résultats accumulés jusqu’alors ont également été présentés au cours de deux congrès internationaux, le premier à Blumenaü au Brésil pendant le Congrès International de Mycoplasmologie (1 au 6 Juin 2014) et le second à Toulouse (Biosynsys, 2 au 4 Juillet 2014).

Récemment, de nouvelles approches rassemblées sous le terme de Biologie de Synthèse (BS) ont émergé. Les travaux menés au J. C. Venter Institute y ont contribué significativement en montrant: (1) la synthèse de génome bactérien complet à partir d’oligonucléotides de synthèse, (2) l’ingénierie génomique en utilisant la levure comme plate-forme, (3) la transplantation de génome bactérien isolé dans une cellule bactérienne, directement ou avec la levure comme intermédiaire. Dans ces travaux, les espèces voisines Mycoplasma capricolum subsp. capricolum (Mcap) et Mycoplasma mycoides subsp. capri (Mmc), ont été respectivement utilisées comme espèces receveuse et donneuse de génome.
Les mycoplasmes appartiennent à la classe Mollicutes, bactéries sans paroi apparentées aux Firmicutes à faible % de G+C. Les mycoplasmes utilisent UGA comme codon Tryptophane et ont un génome de petite taille. Les Mollicutes comportent plusieurs espèces pathogènes chez l’homme, les animaux et les plantes. Un des facteurs limitant l’étude de leur pouvoir pathogène est le manque d’outils génétiques.
L’objectif de SYNBIOMOLL est d’étendre les techniques de Biologie Synthétique à de nouveaux Mollicutes d’intérêt. Dans la mesure où plusieurs génomes bactériens ont été clonés dans la levure et les techniques d’assemblage de grands fragments d’ADN sont en expansion, la limite principale des techniques de BS décrites ci-dessus reste la capacité à étendre la transplantation de génomes à de nouvelles espèces bactériennes.
Dans la tâche 2 (la tâche 1 est la coordination du projet), nous proposons d’étudier les mécanismes de transplantation de génome en évaluant le degré de parenté nécessaire entre la cellule donneuse et le génome transplanté. Des essais de transplantation de génomes d’espèces présentant des parentés phylogénétiques de plus en plus faibles avec Mcap seront réalisés. Après avoir déterminé la limite de la compatibilité, nous chercherons à déterminer si la non-compatibilité résulte d’un défaut de réplication et/ou d’expression du génome donneur dans la cellule receveuse. Pour cela, des régions spécifiques (comme l’origine de réplication) du génome de Mcap seront échangés avec les régions équivalentes d’un génome non-compatible et l’impact sur la transplantation sera déterminé. Les mêmes échanges seront faits avec un génome compatible, comme contrôle. Les résultats attendus devraient renseigner sur la nature des protéines ou de séquences génomiques qui sont critiques pour la compatibilité génome-cellule receveuse dans ces transplantations.
Dans la tâche 3, nous envisageons de développer la transplantation de génome dans un autre groupe phylogénétique, en utilisant Acholeplasma laidlawii (AL) comme cellule receveuse. AL peut être cultivé dans un milieu beaucoup plus simple que celui des mycoplasmes et est considéré comme un intermédiaire entre les mycoplasmes et les firmicutes à faible % G+C.
Des expériences de transplantation avec un génome donneur de même espèce seront réalisées avant de tenter avec des génomes provenant d’autres acholéplasmes. Nous envisageons aussi des développements spécifiques avec des génomes (ou des portions de génomes) provenant de phytoplasmes. Ces derniers sont des mollicutes phytopathogènes transmis par insectes et dont la principale difficulté d’étude provient de leur incapacité à se multiplier in vitro. Dans un premier temps, des plasmides oriC de phytoplasmes seront évalués pour leur réplication chez AL et un remplacement de l’oriC d’AL par celle du phytoplasme sera tenté. Des approches protéomiques seront mises en œuvre pour évaluer la production de protéines de phytoplasmes à partir de gènes clonés chez AL.
Réussir à transplanter un génome dans AL serait une réalisation importante en soi, mais nous souhaitons utiliser ultérieurement ce système pour parvenir à cultiver un phytoplasme après complémentation génomique. Ce projet fera l’objet d’un dossier d’ERC Consolidator Grants déposé par C. Lartigue, à l’issue de SYNBIOMOLL.