Les Exosomes enrichis en ARN viraux sont Médiateurs de la réponse Interféron – EXAMIN

To better our understanding of this newly discovered pathway of innate response activation, we analyze its regulatory mechanisms in the context of infection with two highly pathogenic human viruses for which infected cells similarly trigger robust IFN responses by pDCs. Especially, in the EXAMIN proposal, using multidisciplinary approaches, we plan to pursue the following aims:
I. Defining the biogenesis of PAMP-exosomes by HCV infected cells and their transmission to the pDCs. We will specifically determine:
1/ The ANXA2 function required for the biogenesis, trafficking and/or release of pDC activating signal
2/ The interplay between NS5A and ANXA2 in this process
3/ How HCV PAMP-exosomes are transmitted and captured by the pDCs
II. Defining the molecular basis of pDC activation by DENV infected cells. We will specifically elucidate:
1/ The modality of this short-range pDC activation: contribution of the exosomal pathway, viral determinant(s), phenotypic analysis of activated pDC and impact of infectious virus.
2/ The cellular factors specifically required within DENV infected cells.

DENV is the leading cause of mosquito-borne viral illness and death in humans. Several in vivo studies have demonstrated a key role of the innate immune response in the pathogenesis of DENV infection. We recently uncovered that sensing of DENV infected cells by the pDCs, triggers a robust Toll-like receptor (TLR)7-dependent IFN response. This sensing, which bypasses the blockage of IFN response in infected cells, induces additional antiviral features, including inflammatory cytokine secretion and pDC maturation. We demonstrated that pDC activation depends on cell-to-cell contact, a feature observed for West Nile virus, another member of the Flavivirus genus. We showed that the sensing of DENV infected cells by pDCs requires viral envelope protein-dependent secretion and transmission of viral RNA. Consistently with the cell-to-cell sensing-dependent pDC activation, we found that DENV structural components are clustered at the interface between pDCs and infected cells. The actin cytoskeleton is pivotal for both this clustering at the contacts and pDC activation, suggesting that this structural network likely contributes to the transmission of viral components to the pDCs. Due to an evolutionarily conserved suboptimal cleavage of the precursor membrane protein (prM), DENV infected cells release uncleaved prM containing-immature particles, which are deficient for membrane fusion function. We demonstrate that cells releasing immature particles trigger pDC IFN response more potently than cells producing fusion-competent mature virus. Altogether, our results imply that immature particles, as a carrier to endolysosome-localized TLR7 sensor, may contribute to regulate the progression of dengue disease by eliciting a strong innate response. Finally, this concept might have broad importance for the many viruses that, like DENV, can prevent the pathogen-sensing machinery within infected cells and can release uncleaved glycoprotein-containing non-infectious particles.

By deciphering shared and specific host-virus interplays using evolutionary divergent viruses, we will delineate the general framework of this antiviral response that may have evolved to protect the host against viruses that blunt pathogen-sensing within infected cells.
Additionally, it may have practical importance by identifying a new vulnerability in the life cycle of these human life-threatening viruses that might be targeted for therapeutic purposes. In this respect, we expect that the outcome of the studies of this ANRS JCJC project will result in the discovery of key cellular factors and immune pathways involved in HCV and DENV propagation. This will potentially lead to the identification of novel therapeutic targets that could be used for development of new molecules or therapeutic approaches.
Finally, this project will also contribute to define the regulatory mechanisms of exosomes biogenesis that remains poorly understood.

The works on the aim 2 of the proposal already leads to a publication of an original article (name of lab member is underlined):
Décembre E*, Assil S*, Hillaire MLB, Dejnirattisai W, Mongkolsapay J. Screaton GR, Davidson A and Dreux M. Sensing of Dengue virus infected cells producing immature particles induces an antiviral response by plasmacytoid dendritic cells. PLoS Pathog. 2014 Oct 23;10(10):e1004434.

Our work in this specific area also triggers invitations for review articles/commentaries:
- Assil S, Webster B, Dreux M. Regulation of the host antiviral state by intercellular communications. Viruses. In press.
- Cosset FL, and Dreux M. 2014. HCV transmission by hepatic exosomes establishes a productive infection. J Hepatol 60:674-675
- Assil S, Dreux M. Modulation of permissiveness and antiviral response against hepatitis C virus by interferon lambda-associated polymorphism Med Sci. 2014. 30:1073-5.
- Assil S, Dreux M. Exosomes are carriers for immunostimulatory viral RNA. Med Sci. 2013 29:104-6.

This work led to invitations for oral presentations (M. Dreux) in international and national meetings:
- Journée Jean-Claude Dreyfus de l'Institut Cochin (Paris, Sept. 2015)
- EMBO meeting: human RNA viruses (Istanbul, Oct. 2014)
- Congrès de la Société Française de Microbiologie (Paris, April 2014).

Les acides nucléiques viraux, reconnus par les cellules infectées, induisent une réponse antivirale caractérisée par la production d’interférons (IFN) et de ‘IFN-stimulated genes’ (ISG), qui supprime la propagation virale. Beaucoup de virus, dont le virus de l’hépatite C (VHC) et de la dengue (DENV) ont donc développé des mécanismes qui empêchent l’induction d’IFN par les cellules infectées. Cependant, ces pathogènes provoquent une forte expression d’ISG chez les patients infectés, suggérant l’existence de mécanismes alternatifs de détection des pathogènes. En accord, nous avons récemment démontré que les cellules infectées par le VHC secrètent des exosomes contenant l’ARN du VHC, lesquels transfèrent cet ARN immunostimulateur à des cellules spécialisées pour la production d’IFN, les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) qui, en réponse, produisent de l’IFN (Dreux et al. 2012). De plus, nous avons identifié des facteurs cellulaires requis pour l’activation des pDCs, incluant les protéines “endosomal sorting complex required for transport” (ESCRT) impliquées dans la formation des corps multivésiculés (MVB) et des exosomes, ainsi que l’Annexin A2 (ANXA2). ANXA2 possède de multiples fonctions et participe à divers mécanismes cellulaires tels que, notamment, la régulation de mouvements membranaires. En effet, elle lie les phospholipides et régule l’assemblage de l’actine à la membrane plasmique. ANXA2 a une double fonction au niveau de la membrane plasmique et des endosomes où elle induit des remaniements membranaires et la biogénèse de MVB, respectivement.
Dans une première section, nous définirons la régulation de cette voie d’activation de la réponse antivirale, nouvellement découverte. Spécifiquement, nous examinerons comment ANXA2 contrôle la biogenèse des exosomes immunostimulateurs et quelle(s) fonction(s) cellulaire(s) d’ANXA2 est (sont) usurpée(s) dans ce processus (Task 1). D’autre part, ANXA2 est connue pour être recrutée aux complexes de réplication du VHC via le domaine III de la protéine virale NS5A. Nos résultats préliminaires indiquent que ce domaine est aussi requis pour induire la production d’IFNa par les pDC. Nous déterminerons donc comment ANXA2 et NS5A orchestrent la biogénèse et/ou l’adressage de l’ARN viral produit aux niveau des complexes de réplication, inclus dans des membranes dérivés du réticulum endoplasmique, vers les facteurs et compartiments cellulaires qui permettent leur encapsulation et sécrétion sous forme d’exosomes immunostimulateurs (Task 2). Par ailleurs, nous définirons comment le transfert de ces exosomes est facilité par les contacts cellulaires (Task 3).
De façon intéressante, nos résultats non-publiés suggèrent que les cellules infectées par DENV induisent une forte production d’IFN par les pDC, ce qui similairement au VHC, implique un transfert exosomal. Dans une seconde section, nous analyserons donc les bases moléculaires de cette activation par les cellules infectées par DENV en déterminant : i/ la contribution des exosomes dans le transport de l’ARN immunostimulateur de DENV et les modalités de réponse par les pDCs (Task 4) et ii/ les facteurs cellulaires requis (Task 5).
En conclusion, l’objectif de cette demande ANR JCJC sera de définir, via des approches multidisciplinaires, la série d’interactions hôte-pathogène qui concourent, selon une voie nouvellement identifiée, à l’activation des pDC. En définissant les interactions avec l’hôte, partagées ou spécifiques de chaque pathogène, nous fournirons les fondements d’un mécanisme antiviral qui pourrait avoir évolué pour protéger l’hôte d’agents infectieux qui inhibent la machinerie de détection des pathogènes dans les cellules infectées. De plus, ce travail contribuera à l’identification de nouvelles vulnérabilités de la propagation de ces pathogènes qui pourront être la cible de stratégies thérapeutiques. Enfin, il pourra aider à la compréhension des mécanismes de biogénèse des exosomes, lesquels sont encore peu connus.