Mécanismes d’activation et de désensibilisation d’un récepteur-canal pentamérique – Pentagate

Le programme cherche à intégrer des données structurales à haute résolution (principalement structure cristallographiques), des données structurales locales (via des senseurs fluorescents permettant de suivre des variations de distance inter-résidus tout au long de la structure et en temps réel), des données fonctionnelles d'ouverture du canal par électrophysiologie et de liaison des ligands par résonance plasmonique de surface, et des données de dynamique moléculaire pour simuler la dynamique de la protéine en membrane. la synthèse de molécules marquées (Séléné pour la cristallographie et fluorescentes) vient en support des approches expérimentales, et a pour mission également de développer des ligands ciblant des endroit choisis de la protéine.

Les travaux ont permis de suivre la transition d'activation de GLIC en temps réel par fluorescence, permettant l'identification et la caractérisation fonctionnelle d'un intermédiaire au cours de l'activation. plusieurs classes de composés ont été identifiés comme modulant les transitions allostériques de GLIC, au nombre desquels on peut compter les acides carboxylique, les anesthésiques généraux tels que le propofol, les barbituriques et le Xenon. Leur site de liaison a été identifié par cristallographie et leur mécanisme d'action étudié par dynamique moléculaire. Des pinces moléculaire photoisomérisables ont également été synthetisées dans le but de controler l'ouverture de GLIC par la lumière. Une analyse mutationnelle systématique a permis d'identifier les résidus critiques impliqués dans l'activation de GLIC par les protons, et dans le processus de désensibilisation dont le mécanisme reste inconnu.

Les travaux jettent les bases des mécanismes allostériques régulant l'activité de cette famille de canaux. Les approches technologiques, notamment par fluorescence, chimie et dynamique moléculaire, pourront être étendues au récepteurs humains. La structure de l'état désensibilisé de GLIC reste inconnue, et les efforts seront poursuivis pour la résoudre.

En plus des multiples communication dans des congrès nationaux et internationaux, les travaux ont fait l'objet de 8 publications dans des revues à comité de lecture, et de 2 publications soumises.

Les canaux ioniques activés par les ligands (LGICs) sont des acteurs majeurs de l’excitabilité cellulaire, de la communication neuronale et de la computation dans le cerveau. Cependant, ces protéines membranaires intégrales sont difficiles à produire et à manipuler au plan biochimique, et les mécanismes moléculaires sous-tendant leur fonction restent mal connus. Alors que la structure tridimensionnelle des classes majeures de LGICs a été résolue par cristallographie des rayons X, il reste à comprendre comment les LGICs effectuent la transduction du signal et notamment comment les neurotransmetteurs provoquent l’ouverture de leur canal. Notre projet porte sur les LGICs pentamériques (pLGICs) qui assurent la neurotransmission dans le cerveau par l’acétylcholine, la sérotonine, le GABA et la glycine. Ces récepteurs constituent des cibles thérapeutiques majeures, notamment pour les anxiolytiques, les sédatifs, les anesthésiques généraux, les facilitateurs cognitifs, le neuroprotectants (maladies d’Alzheimer et de parkinson) et les composés anti-tabac. Dans les dernières années, nous avons été à l’avant garde de la recherche sur ces protéines avec la découverte d’homologues bactériens des pLGICs, ouvrant la voie à la résolution structurale de leur conformation active ainsi qu’à l’identification des sites de liaison pour les anesthésiques généraux et pour l’éthanol. Nous cherchons maintenant à surmonter le défit suivant : comprendre les mécanismes moléculaires de l’activation et de la désensibilisation. En effet, les pLGICs sont des protéines allostériques en constante interconversion entre différentes conformations, un état de repos, un état actif caractérisé par un canal ouvert, et un ou plusieurs états désensibilisés.
Dans ce but, nous focaliserons notre étude sur un homologue bactérien issu de la cyanobactérie Gloeobacter violaceus nommé GLIC. Nous utiliserons GLIC comme un prototype de l’ensemble de la superfamille des pLGICs. Nous avons une connaissance approfondie de cette protéine, et nous avons notamment montré qu’elle fonctionnait comme un canal activé par les protons. Nous avons par ailleurs résolu sa structure dans deux conformations à des résolutions jamais égalées parmi les pLGICs. Nous proposons de développer une approche multidisciplinaire large. Nous effectuerons une recherche extensive de ligands et de mutations stabilisant les différentes conformations allostériques de GLIC, en combinant synthèse chimique, mutagénèse dirigée, résonance plasmonique de surface et électrophysiologie. Nous ferons également de l’ingénierie pour générer de novo des sites de modulations au zinc et aux acides aminés. Les mutants de GLIC et les complexes GLIC-ligands sélectionnés seront engagés dans des expériences cristallisation pour la résolution de nouvelles conformations. En retour, la contribution de ces nouvelles conformations au fonctionnement de la protéine sera explorée par le marquage de GLIC par des rapporteurs conformationnels fluorescents. Des expériences à l’équilibre et résolus en temps sur GLIC reconstitué en liposome permettront d’assigner des conformations cristallographiques à des état allostériques, qu’il soient de repos, actifs, désensibilisés, ou même intermédiaires. Enfin, les mécanismes moléculaires sous-tendant les réorganisations allostériques seront explorés par des simulations de dynamique moléculaire sur GLIC inséré dans une membrane lipidique explicite.
Notre approche vise donc à comprendre les mécanismes fondamentaux de la transduction du signal opéré par les pLGICs. Cette connaissance permettra l’identification de nouveaux sites de liaison potentiels, ainsi que leur réorganisation lors de l’activation et de la désensibilisation, ouvrant la voie à la conception de nouvelles classes de médicaments ciblant ces récepteurs du cerveau.