Organisation tridimensionnelle des dommages à l'ADN – SPAREDAM

Lorsque l’intégrité d’un chromosome est menacée par un dommage à l’ADN, en particulier les cassures double brin, la stabilité génomique et le destin cellulaire sont également menacés ; vieillissement cellulaire et carcinogénèse en sont de critiques exemples. Des mécanismes assez sophistiqués de surveillance de l’intégrité génomique et de réparation des dommages existent donc et sont pour la plupart conservés chez les eucaryotes. Alors que ces mécanismes commencent à être bien décortiqués, la régulation spatiale et temporelle de ces dommages et de leur réparation est relativement peu explorée. La structure des foyers de réparation et leur fonction sont ainsi mal comprises et leur existence toujours débattues. Quant à l’importance de l’organisation des génomes dans les voies de réparation, elle commence seulement à être soupçonnée, depuis que les génomes apparaissent comme organisés de façon non aléatoire, L’objectif de ce projet est de déterminer, à travers une approche multidisciplinaire, la structure et la fonction des foyers de réparation en fonction du contexte chromatinien et de l’organisation nucléaire.

Nous avons réuni l’expertise de 3 équipes très complémentaires dans les domaines de la biologie des chromosomes et de la réparation de l’ADN pour relever ce défi. Nous voulons déterminer, à échelle locale, la structure et la dynamique de la chromatine au sein de quelques foyers de réparation, et établir, de manière globale à l’échelle du génome, la carte d’interaction génomique autour de multiples cassures doubles brin. Ceci explique le besoin de regrouper dans cette étude des organismes modèles uni- et pluri-cellulaires, à savoir levure et cellules mammifères. Par ailleurs ce projet repose sur un système astucieux que nous avons établi, qui permet l’induction de plusieurs cassures ciblées — et non pas une seule cassure ciblée ou plusieurs cassures aléatoires auxquelles ce type d’études a généralement recours. Le système de contrôle de l’enzyme de restriction responsable des cassures double brin est également sophistiqué puisqu’il est à la fois inductible et transitoire de façon modulable. La structure locale des foyers de réparation sera ainsi examinée par des outils de microscopie à haute résolution (PALM) que nous avons récemment mise en place à l’Institut Pasteur et par la détermination des composants moléculaires mis en jeu. Par ailleurs l’identité à l’échelle du génome des partenaires ADN impliqués lors de la réparation d’une cassure donnée sera analysée par des technologies faisant intervenir la capture de configurations chromosomiques (appelée ‘3C’), méthode qui a également fait ses preuves entre nos mains. Une fois la structure des foyers de réparation identifiée, deux questions seront posées. A savoir, comprendre les forces sous jacentes à la formation des foyers de réparation et le rôle fonctionnel de ces foyers. Nous y répondrons en faisant appel à un certain nombre de mutants que nous construirons de façon ciblée et en procédant à l’analyse moléculaire des conséquences sur la réparation. Enfin, ce projet ne saurait être complet sans une analyse dynamique de la formation des foyers à laquelle s’ajoute la détermination de leur localisation au sein de l’espace nucléaire. Nous avons développé à cet égard des méthodes modernes de détection ultra dynamique de foyers fluorescents dans des noyaux et de reconstitution en deux dimensions dans l’espace nucléaire de leur localisation.

Nous pensons que chacune des phases de ce projet sont innovantes et décisives à plusieurs égards : la structure des foyers de réparation sera élucidée et leur rôle fonctionnel, en fonction du contexte génomique, mis à jour. Ce projet s’inscrit très clairement dans la ligne des analyses d’avant garde qui prennent en compte le rôle de l’organisation chromosomique et nucléaire dans la régulation des réparations des dommages à l’ADN afin de comprendre comment la qualité de la transmission de l’information génétique est assurée.