Mécanisme de contrôle de systèmes toxine-antitoxine par un chaperon moléculaire chez Mycobacterium tuberculosis. – mycoTAC

Tâche 1 :
-Purification de protéines par FPLC
-Clonage et expression génique et mutagénèse
-Méthodes de purification par affinité
-Analyses protéomiques

Tâche 2 :
-Clonage et expression génique et mutagénèse
-Constructions génétiques
- Purification de protéines par FPLC

Tâche 3 :
-Purification de protéines
-Clonage et expression génique et mutagénèse
-Méthodes de purification par affinité
-Essais de dégradation in vitro

Tâche 4 :
-Purification de protéines
-Purification par affinité
-SEC-MALS/X-ray cristallographie

-Explorer le rôle du chaperon dans l’export des protéines : Nous avons purifié les différentes protéines Sec et identifié une interaction directe entre le chaperon et l’une des protéines Sec par pull-down. Nous avons entrepris une analyse de purification par affinité du chaperon and présence d’extraits cellulaires de M. tuberculosis sauvage et mutant TAC suivie d’une analyse protéomique quantitative, et ainsi identifiés plusieurs protéines potentiellement partenaires du chaperon.
-Cibles de la toxine et rôle dans la virulence : Nous avons construit des souches Tet-inductibles permettant l’expression conditionnelle des membres du système TAC in vivo chez M. tuberculosis. Nous avons aussi muté TAC en présence du chaperon sur un autre locus sous le contrôle d’un promoteur Tet. Nous avons établies la procédure pour purifier la toxine.
-Régulation par les protéases : Nous avons montré que la protéolyse joue un rôle dans l’activation du système et les régions nécessaires à ce processus ont été partiellement définies.
-Etude Structure-Fonction : Nous avons identifié les déterminants structuraux de l’interaction chaperon-antitoxine. A l’aide d’une expérience d’évolution dirigée nous avons identifié une région d’un chaperon impliquée dans la spécialisation du chaperon vers le systeme TAC. Nous avons purifié différents complexes entre les différents partenaires de TAC et réalisés des essais de cristallisation.

Perspectives
-Mise en évidence des déterminants de Sec impliqués dans l’interaction avec le chaperon. Les relations moléculaires entre le système TAC et le translocon Sec seront testées in vitro à l’aide des protéines purifiées déjà disponibles au laboratoire. L’impact de cette nouvelle interaction sera étudié in vivo à l’aide de protéines modèles secrétées ou des nouveaux candidats potentiels identifiés par spectrométrie de masse.
-Des essais d’infection de macrophages et de virulence chez la souris seront réalisés à l’aide de souches Tet-inductibles. Nous allons caractériser les cibles endogènes de la toxine.
-Les relations chaperons protéases et les déterminants structuraux de cette interaction seront étudiés.
-Nous allons poursuivre les essais de cristallisations des différents partenaires.

non

Les polypeptides néo-synthétisés émergeant du ribosome sont pris en charge par des chaperons moléculaires dont la fonction est de faciliter leur repliement et/ou leur adressage vers le cytoplasme, la membrane interne ou la voie d'export. Chez les bactéries à Gram-négatif, le chaperon SecB lie les formes non-natives des précurseurs de protéines exportées et les transfère de manière spécifique au translocon Sec, facilitant ainsi leur passage à travers la membrane interne. Le pathogène humain majeur Mycobacterium tuberculosis, agent responsable de la tuberculose, est une bactérie à Gram-positif atypique car elle possède une membrane externe bien définie et très particulière, la mycomembrane, ainsi que des protéines de membranes externes encore très peu connues. La nature des chaperons moléculaires et facteurs d’adressages potentiellement impliqués dans la biogenèse de ces protéines de membrane externe reste inexplorée. Nous avons récemment montré que les souches du complexe M. tuberculosis possédaient un chaperon atypique Rv1957, apparenté à SecB, qui semble combiner deux fonctions cellulaires importantes. En effet, malgré une faible similarité de séquence avec le chaperon général d’export SecB d'Escherichia coli, Rv1957 est capable (i) de remplacer SecB au niveau de l’export des protéines chez E. coli et (ii) de contrôler spécifiquement un système toxine-antitoxine potentiellement impliqué dans l’adaptation au stress chez M. tuberculosis. Ce nouveau système, appelé «TAC» pour toxine-antitoxine-chaperon, associe pour la première fois un chaperon moléculaire et un système toxine-antitoxine qui pourraient être impliqués dans l’apparition de bactéries persistantes. L’appartenance de Rv1957 à la famille du chaperon d’export SecB suggère qu’il pourrait représenter un lien unique entre un stress affectant l’export des protéines et l’activation d’un système toxine-antitoxine chez M. tuberculosis. Cependant, à ce jour, le mécanisme par lequel le chaperon Rv1957 contrôle la cascade d’activation de la toxine, ainsi que son implication éventuelle dans des phénomènes de persistance restent entièrement inexplorés.
Le projet mycoTAC vise donc à révéler le mécanisme moléculaire d’activation du système TAC ainsi qu'à déterminer son rôle éventuel dans la persistance et la virulence chez M. tuberculosis. Nous envisageons de mettre en évidence le rôle du chaperon de TAC dans l’export des protéines et de tester si ces propriétés sont liées à l’activation du système toxine-antitoxine associé (Tâche 1). En parallèle, nous allons tenter d’identifier le ou les processus cellulaires ciblés par la toxine de TAC (potentiellement l’homéostasie des métaux), ainsi que son implication éventuelle dans la persistance et la virulence chez M. tuberculosis (Tâche 2). En outre, nous allons rechercher la ou les protéases impliquées dans l’activation de TAC, ainsi que les signaux de dégradation présents au niveau de l’antitoxine (Tâche 3). Finalement, nous allons étudier le mécanisme moléculaire de formation de TAC et tenter de résoudre la structure de ses trois membres isolés ou en complexe (Tâche 4). L’ensemble des approches biochimiques, biophysiques, de biologie structurale et in vivo présentées dans ce projet devraient permettre de résoudre le mécanisme moléculaire et la fonction cellulaire de cet élément de réponse au stress atypique chez M. tuberculosis.