Relations entre la dynamique conformationelle du récepteur de la ghréline et sa multiplicité fonctionnelle – ghredyn

Le modèle actuellement proposé pour rendre compte de la plasticité fonctionnelle des RCPG suppose que ces récepteurs oscillent entre plusieurs conformations qui présenteraient plus ou moins d’affinité pour les diverses voies de signalisation. Nous proposions d'apporter une démonstration expérimentale à ce modèle dans le cas du récepteur de la ghréline. Une telle analyse demande la mise en place de stratégies expérimentales élaborées. En effet, seule la combinaison de plusieurs méthodes biophysiques avec des résolutions spatiales et temporelles variées et complémentaires pourra apporter une description complète de l'espace conformationnels que peut explorer un récepteur. Nous avons donc mis en oeuvre une approche multidisciplinaire inédite associant les techniques de chimie, de biochimie, de biophysique en solution et de cristallographie. La dynamique conformationelle est ainsi explorée en combinant la fluorescence et la RMN en solution. Ces techniques sont appliquées au GHS-R1a purifié et reconstitué dans un environnement membranaire modèle, les nanodisques lipidiques, en absence et en présence de ligands de nature pharmacologique variée et des différentes protéines de signalisation purifiées. En parallèle, nous cherchons à déterminer, par cristallographie aux rayons X, la structure du récepteur de la ghréline stabilisé dans sa conformation inactive par le antagonistes et/ou agonistes inverses originaux dont nous disposons. Associée aux méthodes de modélisation moléculaires que nous mettons en oeuvre pour prédire les variations de la structure du GHS-R1a le long de son chemin d'activation, cette étude par radiocristallographie devrait nous permettre de replacer les observations de dynamique dans un contexte structural précis.

Comme indiqué plus, nous proposions d'analyser la dynamique conformationnelle du récepteur de la ghréline par fluorescence, RMN et cristallographie. Les principaux résultats obtenus sont donnés ci-dessous.
Fluorescence – nous avons mis au point l'introduction de sondes fluorescentes sur le récepteur exprimé dans la bactérie E. coli par la technique des acides aminés non-naturels; ceci nous a permis de montrer, par transfert de fluorescence résolu dans le temps, que (i) le récepteur existe sous plusieurs conformations différentes; (ii) les ligands affectent les populations relatives de ces espèces en relation avec leurs propriétés pharmacologique. (iii) que le récepteur est précouplé à sa protéine G. L'ensemble de ces résultats est décrit dans un article publié en 2015 dans PNAS.
RMN en solution – Nous nous proposions d'étudier la multiplicité conformationnelle du récepteur GHS-R1a par RMN multidimensionnelle en solution en utilisant des sondes 13CH3 spécifiquement introduites, par voie biosynthétique, au niveau de certains acides-aminés d'un récepteur perdeutéré. Nous avons, dans un premier temps, mis au point ce marquage isotopique. L'échantillon ainsi obtenu a donné lieu à des spectres RMN de grande qualité, ouvrant la voie à l'analyse spectroscopique.
Cristallisation – La première partie du projet consistait à identifier, parmi tous les ligands du GHS-R1a synthétisés à l'IBMM, ceux qui seraient le plus favorables à la cristallisation. Pour cela, nous avons mis au point un test qui nous a permis d'identifier des composés aux propriétés pharmacologiques différentes qui s'associent de façon quasi-irréversible au récepteur. Par ailleurs, le GHS-R1a a eté produit dans des quantités de l'ordre du mg sous forme d'une protéine purifiée et totalement fonctionnelle. De premiers essais de cristallisation ont alors été mis en œuvre qui ont conduit à l'identification de conditions qui pourraient être plus favorables à la cristallisation du GHS-R1a (micro-cristaux).

Sur la base des résultats obtenus, nous poursuivrons nos travaux de :
Fluorescence – Nous nous proposons désormais d'étendre les travaux décrits plus haut à l'étude, par la même méthode, de l'influence des lipides et de la dimérisation avec d'autres RCPG sur la variabilité conformationnelle du récepteur GHS-R1a.
RMN en solution – L'ensemble des travaux de biochimie décrits plus haut (marquage isotopique, reconstitution dans des nanodisques lipidiques de taille compatible avec la RMN) nous a permis d'enregistrer des spectres avec une résolution inégalée dans le domaine des RCPG. Nous tirerons profit de cette haute résolution pour analyser la multiplicité fonctionnelle du GHS-R1a et de la façon dont elle est modulée par les ligands, les lipides…
Cristallisation du récepteur GHS-R1a – Les essais de cristallisation en cours ont permis l'identification de conditions qui pourraient être plus favorables à la cristallisation du GHS-R1a (obtention de micro-cristaux). Nous poursuivons actuellement ces essais pour optimiser les conditions de cristallisation et vue d'obtenir des cristaux de taille compatible avec une analyse structural par diffraction des RX.

Damian M, Mary S, Maingot M, M'Kadmi C, Gagne D, Leyris JP, Denoyelle S, Gaibelet G, Gavara L, Garcia de Souza Costa M, Perahia D, Trinquet E, Mouillac B, Galandrin S, Galès C, Fehrentz JA, Floquet N, Martinez J, Marie J, Banères JL. (2015) Ghrelin receptor conformational dynamics regulate the transition from a preassembled to an active receptor:Gq complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 112:1601-6.

La ghréline est une hormone peptidique aux effets biologiques pleïotropes. A côté de sa fonction orexigène, elle influence de nombreuses voies neuroendocriniennes, extraendocriniennes et métaboliques. Elle contrôle aussi les mécanismes neurobiologiques qui sous-tendent différentes formes de comportements addictifs tels que la consommation compulsive de nourriture et l’addiction aux drogues et à l’alcool. L'ensemble des effets induits par la ghréline résulte de sa liaison à un récepteur membranaire, le GHS-R1a, qui appartient à la famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Du fait des effets biologiques multiples de la ghréline, le GHS-R1a est une cible privilégiée pour le développement de molécules à visée thérapeutique avec des applications potentielles dans le traitement de la cachexie, de l'obésité, du diabète ou de l'addiction.
La diversité des effets biologiques induits par la ghréline trouve son origine dans la multiplicité des voies de signalisation pouvant être activées par son récepteur. En effet, le GHS-R1a, comme la plupart des RCPG, peut engager plusieurs partenaires intracellulaires pour orchestrer une signalisation dépendante ou indépendant des protéines G. La dimension plurielle de l’efficacité de signalisation du GHS-R1a offre de nouvelles opportunités pour le développement de médicaments qui cibleraient sélectivement les voies de signalisation importantes pour leur action thérapeutique et présenteraient, de ce fait, une efficacité accrue et des effets indésirables réduits. Cependant, la conception de ces molécules de nouvelle génération reste limitée par une connaissance incomplète de la nature des déterminants moléculaires responsables de la sélectivité de signalisation.
Le modèle actuellement proposé pour rendre compte de la plasticité fonctionnelle des RCPG suppose que ces récepteurs oscillent entre plusieurs conformations qui présenteraient plus ou moins d’affinité pour les diverses voies de signalisation. La stabilisation de ces conformations nécessiterait les contraintes allostériques fournies à la fois par la liaison du ligand et les protéines de signalisation. Nous proposons ici d'apporter une démonstration expérimentale à ce modèle dans le cas du récepteur de la ghréline. Une telle analyse demande la mise en place de stratégies expérimentales élaborées. En effet, seule la combinaison de plusieurs méthodes biophysiques avec des résolutions spatiales et temporelles variées et complémentaires pourra apporter une description complète de l'espace conformationnels que peut explorer un récepteur. Nous mettrons donc en œuvre une approche multidisciplinaire inédite associant les techniques de chimie, de biochimie, de biophysique en solution et de cristallographie. La dynamique conformationelle sera ainsi explorée en combinant la fluorescence en molécule unique et la RMN en solution. Ces techniques seront appliquées au GHS-R1a purifié et reconstitué dans un environnement membranaire modèle, les nanodisques lipidiques, en absence et en présence de ligands de nature pharmacologique variée et des différentes protéines de signalisation purifiées (protéines G, arrestines, GRKs, µ-AP2). En parallèle, nous chercherons à déterminer, par cristallographie aux rayons X, la structure du récepteur de la ghréline stabilisé dans sa conformation inactive par le antagonistes et/ou agonistes inverses originaux dont nous disposons. Associée aux méthodes de modélisation moléculaires que nous mettrons en œuvre pour prédire les variations de la structure du GHS-R1a le long de son chemin d'activation, cette étude par radiocristallographie devrait nous permettre de replacer les observations de dynamique dans un contexte structural précis. L'ensemble de ces travaux apportera ainsi une description détaillée des évènements moléculaires reliant la stabilisation d’une conformation particulière du récepteur à l'activation sélective d'une voie de signalisation et, par conséquent, à la sélection d’une réponse biologique.