Activité, organisation et fonction du facteur « Elongator » – Elongator
The main objectives of this project were:
1 Determination of the structural organization of the Elongator complex and of its mode of interaction with partners: The aim was to obtain the structure of individual subunit by X-ray analyses and if possible of sub-ccomplexes or of the full assembly.
2 Analysis of the biochemical activity of Elongator: We proposed to develop a biochemical assay to study Elongator activity in vitro.
3 Using biological diversity to investigate Elongator function: We proposed to use complementation between distant species using divergent systems to assay Elongator activity.
4 Characterization of molecular defects resulting from Elongator dysfunction in cells: We aimed to understand how alteration of Elongator activity affects cellular functions in yeast and eventually in mammalian cells.
- We obtained the structure of the Elp2 subunit. We also mapped interacting region linking the Elp4/5/6 subcomplex to subdomains of Elp1. The Elongator complex was also purified from yeast and, thanks to technological improvement in structural electron microscopy, we obtained envelopes of the full complex albeit at low resolution. Yeast strains with specifically tagged subunits were produced to allow the location of individual components in the full assembly. Turning to more distant organism, we identified a homologue of one subunit in bacteria, expressed it and solved its structure. A manuscript on this protein is submitted for publication.
- Focusing on Elongator partners and combining sequence similarities and information from the literature, we hypothesized that the role of the Kti11-Kti13 Elongator co-factor was to deliver electrons to the catalytic subunit of the complex. This electron transfer would be a prerequisite for the biochemical reaction. To support this conclusion, we obtained the structure of the Kti11-Kti13 dimer and established its electron transfer activity. These results have been published.
- We attempted to reconstitute Elongator activity in vitro using yeast, bacterial and archaeal proteins. We were unsuccessful so far. A competitor published the reconstitution of Elongator-like activity using an archaeal protein. Despite many efforts, we have been unable to reproduce these data. In particular, we developed anaerobic protein purification to protect the iron-sulfur cluster from oxygen-induced damage. This cumbersome procedure helped obtaining better quality protein.
- We attempted to complement defects if yeast Elongator by overexpression of an archaeal protein without success. We also tested whether archaeal and bacterial Elongator-like proteins can substitute and complement for a defect of a paralogous E. coli tRNA purification system. No complementation was observed.
The project progresses and our understanding of Elongator function improves. Technical difficulties slow down part of the project but adapted strategies to short-cut these limitations are implemented.
Publication: Structure of the Elongator cofactor complex Kti11/Kti13 provides insight into the role of Kti13 in Elongator-dependent tRNA modification. Kolaj-Robin O, McEwen AG, Cavarelli J, Séraphin B.FEBS J. 2015 Mar;282(5):819-33. doi: 10.1111/febs.13199. Epub 2015 Feb 4.
Structural basis for tRNA modification by Elp3 from Dehalococcoides mccartyi. Glatt S, Zabel R, Kolaj-Robin O, Onuma OF, Baudin F, Graziadei A, Taverniti V, Lin TY, Baymann F, Séraphin B, Breunig KD, Müller CW. Nat Struct Mol Biol. 2016 Sep;23(9):794-802.
Meetings:
1. Identifying and purifying protein complexes. EMBO Practical Course on Structural Characterization of Macromolecular Complexes Grenoble, June 2-7, 2014
2. Identifying and purifying protein complexes. EMBO Practical Course on Structural Characterization of Macromolecular Complexes Grenoble, May 21-27, 2016
3. Regulatory Networks of the Eukaryotic Elongator Complex. tRNA Conference 2016. Jeju, Korea, Sept 4-8, 2016.
Architecture of the yeast Elongator complex. EMBO Conference «Molecular machines: Intregrative structural and Molecular Biology« Heidelberg 20-23 November 2016
Le complexe eucaryote Elongator, originellement identifié comme partenaire de la polymérase II de Saccharomyces cerevisiae, est constitué de 6 sous-unités fortement conservées. La présence dans sa sous-unité Elp3 d'un domaine similaire aux histone acetyltranferases a conduit à des expériences suggérant un rôle d'Elongator dans l’acétylation des histones. Depuis, Elongator a été impliqué dans de nombreux processus comme la déméthylation de l’ADN, l’acétylation de la tubuline, l’exocytose, la modification d’ARNt, la réparation de l’ADN… L’intérêt pour Elongator a été renforcé par le fait que des mutations de certaines de ses sous-unités génèrent des maladies humaines. Ainsi, des mutations réduisant l’expression d’Elp1 sont responsables d'un syndrome rare affectant la survie de neurones des systèmes autonome et sensoriel, tandis que des variants des homologues humains d’Elp3 et Elp4 contribuent à d'autres maladies du système nerveux. En accord avec ces observations, des souris mutantes ont démontré que l’inactivation de Elp1/IKBKAP est mortelle tandis que son expression réduite engendre une neuropathie. La compréhension de la fonction moléculaire d'Elongator permettra d’accroître nos connaissances et d’élucider les bases de ces pathologies.
La variété de mécanismes dans lesquels Elongator a été impliqué rend la recherche de son activité biochimique particulièrement ardue. Des indices importants ont été fournis par l’observation que, chez S. cerevisiae et S. pombe, la surexpression d’ARNt spécifiques supprime les différents phénotypes découlant de l’inactivation d'Elongator.
Suite au développement de la technologie TAP, notre groupe a initié il y a quelques années une étude structurale de l'organisation d'Elongator en collaboration avec une équipe de l’EMBL. Ceci permis récemment la résolution de la structure cristalline d'un sous-complexe Elongator contenant Elp6 complet avec Elp4 et Elp5 tronqués. Ces résultats ont révélé inopinément qu'Elp4-Elp5-Elp6 forme une structure en anneau similaire aux hélicases hexamériques. Ces résultats nous ont incités à examiner les activités possibles d'Elongator dans le métabolisme des acides nucléiques. Nous avons observé une association régulée par l’hydrolyse de nucléotide d'Elongator avec des ARNt, renforçant le lien entre Elongator et les modifications d’ARNt. Des données non publiées de notre groupe confortent cette connexion.
De façon intrigante, malgré les efforts de nombreuses équipes depuis des années, plusieurs questions clé liées à Elongator restent non résolues. Ceci inclut la définition de l'organisation d'Elongator; la caractérisation de sa fonction biochimique, particulièrement de son rôle possible dans la catalyse de modifications d’ARNt; d’arriver à trancher si les divers phénotypes de mutants d’Elongator résultent indirectement de l’absence de modification d’ARNt ou du fait de l’implication d’Elongator dans plusieurs voies indépendantes; et de comprendre comment la réduction de l’activité d’Elongator contribue aux maladies humaines. Étant donné l'intérêt général et médical d'Elongator, nous proposons d'examiner ces questions. En collaboration avec le groupe de Christtoph Müller à EMBL, le projet initié par notre étude structurale d’Elp4-Elp5-Elp6 sera étendu pour permettre la compréhension de l’organisation d’Elongator. Notre groupe fera des efforts importants pour définir la fonction biochimique d'Elongator dans la modification des ARNt. Des études phylogénétiques et des approches de biologie synthétiques seront aussi implémentées pour définir la fonction conservée d'Elongator et de ses homologues. Ces expériences chercheront aussi à différencier les conséquences indirectes de l’inactivation d’Elongator de sa fonction cellulaire propre. Des tests moléculaires de l'activité Elongator seront aussi développés. Ils permettront de tester les conséquences d’une expression réduite d’Elongator dans des cellules de mammifères, fournissant éventuellement une base aux pathologies associées.
Coordination du projet
Bertrand SERAPHIN (Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire)
L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.
Partenaire
IGBMC Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire
Aide de l'ANR 220 000 euros
Début et durée du projet scientifique :
février 2014
- 42 Mois
