Oxydation du peptide amyloïde bêta et conséquences dans l'étiologie de la maladie d'Alzheimer. – AlzABox

Basé sur une approche innovante et multidisciplinaire, le projet AlzABox met en œuvre un large éventail de méthodologies, de la chimie jusqu’à la biologie. Tout d’abord, une caractérisation fine de l’oxydation du peptide AB in vitro sera menée, de manière à identifier les résidus oxydés et la nature de l’oxydation, à étudier l’influence du temps d’oxydation, et ainsi à révéler les cibles précoces et préférentielles des espèces réactives de l’oxygène (ROS) durant l’oxydation. Des techniques avancées basées sur la spectrométrie de masse seront mise en œuvre, dont le couplage avec la chromatographie liquide (HPLC/MS) en MS basse ou haute résolution, ou encore le couplage avec la mobilité ionique. La coordination des ions métalliques (tels que le cuivre et le zinc) au peptide oxydé sera étudiée par résonance paramagnétique électronique (RPE), résonance magnétique nucléaire (RMN) ou spectroscopie d’absorption X (XAS).
En complément, l’oxydation de AB sera également caractérisée in vivo, sur deux modèles de souris transgéniques développant AD, et sur des biopsies de cerveaux de patients décédés. Les peptides AB (y compris les formes tronquées ou oxydées) seront extraits par immunoprécipitation à l’aide de billes magnétique et d’anticorps dirigés contre les parties C- et N-terminales du peptide. Une attention particulière sera portée à l’analyse des espèces oxydées, et les résultats seront comparés à ceux obtenus avec les modèles in vitro.
Enfin, les conséquences de l’oxydation de AB sur l’agrégation, la production de ROS et la toxicité cellulaire seront étudiées par différentes méthodologies, incluant celles basées sur la spectroscopie de fluorescence. Les espèces oxydées de AB (échantillons in vivo et in vitro) seront caractérisées quant à leur propension à agréger, en absence ou présence d’ions métalliques (cuivre et zinc), à produire des ROS et à être toxiques vis-à-vis de cellules de neuroblaste de type SH-SY5Y.

Le projet AlzABox, à travers son approche innovante et multidisciplinaire, peut conduire à plusieurs retombées scientifiques et techniques, à moyen et long terme. Les trois aboutissements majeurs attendus sont : i) développer un modèle in vitro parfaitement maîtrisé et adapté pour l’étude de la propension de différentes molécules synthétiques originales à inhiber la production de ROS, la toxicité cellulaire ou l’agrégation du peptide AB ; ii) mettre en place un système de purification en routine d’espèces oxydées du peptide AB à partir d’échantillons complexes, d’en identifier certaines comme biomarqueurs précoces du développement de la maladie d’Alzheimer (AD), et d’appliquer cette méthodologie au développement d’un diagnostic de AD basé sur les outils de la microfluidique ; iii) ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblées, basées sur la compréhension de l’oxydation de AB comme conséquence quant aux mécanismes impliqués dans l’étiologie de AD.

Comme première perspective, un modèle in vitro bien maîtrisé serait un outil puissant pour développer de nouveaux composés, comme des complexes de platine ou de ruthénium, capables d’interagir avec le peptide AB, en compétition avec les ions métalliques habituellement coordonnés au peptide, tels que le cuivre, le fer ou le zinc. Certains complexes sont actuellement en cours d’étude et semblent prometteur quant à leur propension à inhiber l’agrégation de AB en particulier. Ce point pourrait conduire à plus long terme au développement de nouveaux médicaments. Un tel développement prendra également en compte le ciblage de l’oxydation du peptide AB par des composés ayant des propriétés antioxydantes.
Parce que la maladie d’Alzheimer se développe sur plusieurs décades avant de se déclarer, et parce qu’il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement curatif, la possibilité de développer un diagnostic précoce est un challenge très important. L’une des autres perspectives du projet AlzABox est l’identification possible de certaines espèces oxydées de AB qui pourraient être suffisamment spécifiques pour être utilisées comme biomarqueurs, à différents stades du développement de la maladie. A plus long terme, la stratégie proposée dans le projet pour la purification de AB oxydé à partir d’échantillons complexes (immunoprécipitation à l’aide de billes magnétiques) pourrait conduire au développement et à l’optimisation d’outils basés sur la microfluidique pour le diagnostic précoce et rapide de la maladie.

-

La maladie d’Alzheimer (MA) est la première cause de démence chez les personnes âgées, avec une personne sur vingt touchée dans le monde. L’une de ses caractéristiques est l’observation post-mortem de plaques séniles, composées principalement du peptide amyloïde bêta (Aß) et des ions métalliques (cuivre, fer ou zinc). Le peptide Aß s’agrège en fibrilles amyloïdes, retrouvées dans les plaques séniles, alors qu’il est présent sous forme soluble chez les sujets sains. Ainsi, l’agrégation est un processus critique dans le développement de la maladie et ses intermédiaires (souvent appelés oligomères) semblent être les espèces les plus toxiques, capables d’initier un stress oxydant par la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS). Si les ions métalliques (Cu, Fe) sont impliqués dans la production de ROS, ils peuvent également se lier directement au peptide Aß et participer à son auto-agrégation. Ainsi, les complexes formés entre les ions métalliques et le peptide Aß seraient responsables d’une toxicité induite accrue, impliquée dans le développement de MA. L’étude de ces complexes apparaît comme particulièrement prometteuse dans la compréhension des mécanismes qui sous-tendent le développement de cette maladie.
L’objectif du projet AlzABox est d’étudier les relations existantes entre le stress oxydant induit par les ions métalliques, les dommages subit par le peptide Aß et les conséquences qui en découlent sur les mécanismes majeurs impliqués dans l’étiologie de MA (agrégation, production de ROS et toxicité cellulaire). Le projet propose une approche pluridisciplinaire, aux frontières de la chimie, de la biologie et du vivant, de manière à i) caractériser finement les dommages oxydatifs subit par le peptide Aß par l’étude de modèles in vitro et in vivo, ii) comprendre les conséquences de l’oxydation du peptide Aß sur ses capacités d’agrégation, sa production de ROS, sa coordination avec des ions métalliques et sa toxicité cellulaire, iii) établir des mécanismes d’oxydation, biologiquement pertinent, pouvant être impliqués dans le développement de la maladie. Des méthodologies analytiques basées sur la spectrométrie de masse (couplage à la chromatographie, haute résolution), la chimie de coordination, la biologie de systèmes cellulaires ou vivants sont autant de disciplines qui participeront à l’enrichissement des connaissances au niveau moléculaire, tout en assurant la pertinence biologique, clés du succès du projet.
L’approche novatrice et originale proposée dans le projet AlzABox doit permettre d’identifier les modifications subies par le peptide Aß, en conditions de stress oxydant : identification des acides aminés oxydés, nature de l’oxydation en relation avec l’état initial d’agrégation du peptide Aß (monomères, oligomères, agrégats amorphes, fibrilles), définition des cibles privilégiées par les ROS et influence du facteur temps, événements primaires du processus d’oxydation. L’examen des modes de coordination des espèces oxydées de Aß aux ions métalliques (Cu+, Cu2+, Zn2+) puis les capacités de celles-ci à s’agréger, à produire des ROS ou à présenter une toxicité cellulaire devrait permettre de proposer le ou les mécanismes responsables de l’oxydation du peptide Aß et de son impact délétère sur les neurones. Les résultats obtenus sur modèles murins de MA à différents stades de son développement, ainsi que sur des échantillons de cerveaux de patients décédés de MA, seront analysés et comparés aux résultats acquis sur les modèles in vitro. Ces études comparées permettront de dégager des mécanismes majeurs, biologiquement pertinents.
Finalement, l’approche duale modèles in vitro/essais in vivo du projet AlzABox devrait contribuer de façon significative à renforcer la connaissance scientifique de la pathologie de MA, et ultérieurement, donner naissance à de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant les stades précoces de la maladie.