Développement d’une nanoparticule luminescente à base de lanthanides pour la quantification dynamique de l’autophagie in vitro et in vivo. – Lumiphage

L’autophagie est un processus d’auto-digestion cellulaire majeur impliqué dans l’homéostasie des cellules et des organismes. Son importance est largement reconnue à travers les domaines de recherche du développent, de la neurodégénération, du cancer, des infection par des pathogènes ainsi que dans l’obésité. En raison de son implication dans les maladies et dans l’efficacité des thérapies, et en considération de l’émergence de la médecine personnalisée, nous anticipons que le développement d’outils moléculaires permettant d’imager et de quantifier de façon non-invasive l’autophagie in vivo auront un impact important sur les thérapies.
Alors que plusieurs outils conventionnels ont été développés pour l’étude in vitro de l’autophagie, aucun d’entre eux ne peut être exploité in vivo. Nous proposons de développer dans cette étude une nanoparticule permettant d’obtenir des informations dynamiques et quantitatives sur le flux autophagique in vitro et in vivo. Le flux autophagique est décrit par les étapes successives qui conduisent à la dégradation du cargo autophagosomal par les enzymes lysosomales à pH acide depuis la formation des autophagosomes jusqu’à leur fusion avec les lysosomes. Cette dernière étape est décisive dans les effets physiologiques de l’autophagie, mais aujourd’hui aucun test ne permet de mesure facile et dynamique dans des cellules non-transfectées.
Dans ce projet, nous allons produire un dendrimère luminescent à base de lanthanides adressé aux autophagosomes et exploiter l’acidification du pH dans les étapes tardives de l’autophagie pour mesurer l'activité autophagique. Pour cela, un système de transfert d’énergie sensible au pH depuis un chromophore organique, appelé antenne, vers les lanthanides sera utilisé et la luminescence des lanthanides sera mesurée in vitro par microscopie de fluorescence, cytométrie et spectroscopie et dans le proche-infrarouge in vivo à l’aide d’un microscope proche-infrarouge.
Notre expertise dans la chimie des complexes lanthanides, et des fluorophores nous permet d’implémenter de multiples stratégies pour produire les quatre éléments constituant de la sonde. Tout d’abord, plusieurs antennes visibles et proche-infrarouge qui ont été produites ou sont en cours de développement dans notre groupe seront criblées afin de sélectionner une antenne optimale pour les lanthanides. Ensuite, nous avons choisi de développer un dendrimère janus car il a été démontré que démontré ces nanoparticules sont facilement fonctionnalisables et présentent des caractéristiques biocompatibles. Troisièmement, la sensibilité au pH sera amenée par un lien imine entre l’antenne et le dendrimère. Cette stratégie a été validée dans notre groupe pour le transfert depuis un fluorophore organique vers l’ytterbium. Enfin, l’adressage de la nanoparticule vers les autophagosomes sera ajusté à l’aide d’une chimie de surface à base de peptides modulateurs de l’autophagie des nanoparticules récemment identifiés.
Les propriétés photophysiques des sondes seront caractérisées à l'aide de techniques avancées de spectroscopie visible et proche-infrarouge et par des mesures de temps de vie. Pour finir, l'aspect fonctionnel de la sonde sera testé in vitro dans des cellules cancéreuses traitées avec des inhibiteurs de PI3Kinases inducteurs de l'autophagie, et des agents inhibiteurs du flux autophagique ainsi que sur des cellules pour lesquelles l'expression de ATG7 ou Beclin-1 aura été inhibée. La localisation et l'activité de la sonde seront comparées aux résultats obtenus avec les techniques standard utilisées pour l’étude de l’autophagie. Ces tests in vitro seront suivis d’une validation in vivo de l’activité de la sonde sur des souris porteuses de tumeurs traitées avec des agents chimiothérapeutiques qui modulent l’autophagie. Un microscope équipé d’une caméra sensible au proche-infrarouge sera utilisée pour l’imagerie animale afin de quantifier l’autophagie in vivo.