Assemblage Viral et Dynamique des Domaines Membranaires – FLUOBUDS

Les rétrovirus sont des virus enveloppés à ARN impliqués dans de nombreuses maladies affectant l’homme. L’assemblage des rétrovirus a lieu à la membrane plasmique des cellules infectées. La protéine virale Gag orchestre l’assemblage viral en s’accrochant aux membranes cellulaires grâce à son extrémité N-terminale myristoylée et plusieurs résidus basiques conservés dans son domaine matrice (MA). Ce domaine de Gag interagit avec un phosphoinositide particulier (le PI(4,5)P2) localisé dans le feuillet interne de la membrane plasmique.
L’objectif de ce projet est d’étudier l’assemblage des rétrovirus du point de vue de l’interaction Gag-lipides. Pour cela nous caractériserons l’interaction dynamique des PIP2 avec la protéine virale Gag dans des membranes modèles et en cellules vivantes, grâce à des approches de biophotonique complétées par l’élaboration de nouvelles sondes PIP2 fluorescentes. Ces sondes seront synthétisées par les chimistes de l’ENS de Lyon, avec des fluorophores dédiés. Les sondes PIP2 fluorescentes commerciales existant actuellement présentent l’inconvénient de porter le fluorophore sur une de leurs deux chaînes d’acide gras, ou sur leur tête polaire. Les nouvelles sondes PIP2 envisagées ici laisseraient intactes les deux chaînes d’acide gras (ancrage et partitionnement dans les membranes) et la tête inositol phosphorylée (interaction avec le domaine MA de Gag), l’insertion du fluorophore se faisant sur l’extrémité 3’ du glycérol. Ces nouvelles sondes PIP2 seront testées en cellules par microscopie de fluorescence pour leur toxicité, leur efficacité de fluorescence et leur capacité à intégrer la membrane cellulaire. L’interaction du domaine MA de Gag sauvage ou mutant (protéines recombinantes) avec des membranes artificielles contenant le PIP2, et autres composés lipidiques, sera caractérisée afin de définir les résidus engagés dans cette interaction. Puis, nous testerons la capacité des protéines virales Gag à s’oligomériser sur ces microdomaines PIP2 ou à les générer, dans des membranes modèles ou des cellules vivantes exprimant le rétrovirus MuLV, ceci par des techniques de biophotonique adaptées aux études de dynamique et d’interaction (svFCS, RICS, spt-PALM, et FLIM). Un des objectifs du projet est de synthétiser ces nouvelles sondes lipidiques fluorescentes, en particulier pour la microscopie PALM dynamique. L’autre objectif est de définir les déterminants protéiques et lipidiques impliqués dans l’assemblage des rétrovirus par la caractérisation de l’interaction du domaine MA avec le PIP2, in vitro et in cellulo. Ceci aura pour but le développement de nouvelles stratégies antivirales.
Ce projet à l’interface de la chimie, de la biophysique, de la virologie et de la biologie cellulaire fournira des données nouvelles à la fois sur la dynamique membranaire des PIP2, et des Gag rétrovirales, sur le rôle des lipides acides dans l’assemblage des virus enveloppés à ARN et permettra à plus long terme de développer des drogues antivirales ciblant les interactions virus-lipides.