Interactions entre les rétroélements et la cellule hôte: De l’import nucléaire à l’intégration chromosomique – NiCiTy

Les rétroélements à LTR (LTR-RT) sont omniprésents dans les génomes eucaryotes. L’étude des LTR-RT de levure a contribué à une meilleure connaissance de la biologie des rétrovirus. C’est pourquoi, nous utiliserons le LTR-RT Ty1 de levure, comme modèle d’étude.
Objectif 1 : Etudier l'influence de la transcription sur le choix du site d'intégration de Ty1, en reconstituant des systèmes d’intégration in vitro sophistiqués, permettant d’étudier l’intégration de Ty1 couplée à une transcription active; et par des stratégies novatrices afin d'identifier in vivo, de nouveaux cofacteurs de Ty1, impliqués dans l'import nucléaire et l'intégration, en particulier ceux présents au site d’intégration.
Objectif 2 : Déterminer l'impact de l'architecture des chromosomes dans l'intégration rétrovirale, ainsi que l'influence des insertions rétrovirales sur l'organisation tridimensionnelle du noyau, en utilisant les outils les plus modernes pour suivre la position des loci Ty1 dans les cellules vivantes et cartographier leur position en deux dimensions dans l'espace nucléaire, et pour comparer la position de plusieurs loci avant et après intégration de Ty1.
Objectif 3 : Décrypter la contribution du spindle pole body (le centrosome de levure) et du réseau de microtubules dans la réplication de Ty1, en analysant la localisation de Ty1 et des protéines du SPB par microscopie à fluorescence hautement résolutive ; en déterminant si un SPB fonctionnel est nécessaire pour la réplication de Ty1, par des approches génétiques et génomiques.

Résultat majeur. Elucidation du mécanisme de sélection du site d’intégration de Ty1 en amont des gènes transcrits par l’ARN polymérase III (Pol III). Une des étapes clés de la réplication des rétroéléments est l’intégration d’une copie ADN, obtenue par transcription inverse de leur ARN, dans le génome de la cellule hôte. Cette étape est effectuée par l’intégrase, une enzyme codée par les rétroéléments. Ty1 s’intègre majoritairement dans une fenêtre d’une kilobase en amont des gènes transcrits par l’ARN Polymérase III (Pol III). Nous avons démontré que la protéine AC40 de la Pol III joue un rôle essentiel dans l’intégration sélective de Ty1. La perte d’interaction entre AC40 et l’intégrase conduit à une diminution drastique de l’intégration en amont des gènes transcrits par Pol III sans diminuer la fréquence d’intégration. L’analyse à grande échelle des nouveaux sites d’intégration indique une redistribution de Ty1 dans tout le génome et en particulier au niveau des régions subtélomèriques qui sont des régions dépourvues de gènes essentiels. Le mécanisme d’intégration ciblée de Ty1 permet donc au rétrotransposon de proliférer tout en minimisant les risques de mutagénèse. La découverte de l’interaction entre AC40 et l’intégrase et de son rôle essentiel dans la sélectivité d’intégration de Ty1 est une avancée majeure dans la compréhension des mécanismes qui ciblent l’intégration de Ty1. En parallèle, nous avons construit les outils qui permettront d’identifier les cofacteurs associés au complexe d’intégration, situé ou non au niveau d’un site préférentiel d’intégration.
Les outils moléculaires pour marqué des loci génomiques et les outils d’analyse pour suivre leur comportement dynamique sont en cours de construction.

- identifier de nouveaux partenaires cellulaires Ty1;
- décrypter au niveau moléculaire le lien entre la transcription et le processus d'intégration;
- déterminer l'impact de l'organisation tridimensionnelle des chromosomes sur le processus d'intégration;
- acquérir des connaissances sur la contribution du SPB dans la réplication de ty1.
Ce projet devrait aussi ouvrir de nouvelles pistes pour étudier les interactions entre les mécanismes cellulaires et les rétrovirus de mammifères, et avoir donc des implications importantes en thérapie clinique pour le traitement des infections rétrovirales et pour le développement de nouveaux vecteurs rétroviraux pour la thérapie génique.

A) PUBLICATIONS
1) Bridier-Nahmias A., Tchalikian-Cosson A., Baller J., Menouni R., Fayol H., Flores A., Saïb A., Werner M., Voytas DF and Lesage P. (2015) An RNA polymerase III subunit determines sites of retrotransposon integration. Science. 2015 May 1;348(6234):585-8.
2) Curcio MJ., Lutz S. & Lesage P. (2015). The Ty1 LTR- retrotransposon of budding yeast, Saccharomyces?Microbiol Spectr. 2015 Apr;3(2).1-35.
3) Nguyen NT, Saguez C, Conesa C, Lefebvre O, Acker J. Identification of proteins associated with RNA polymerase III using a modified tandem chromatin affinity purification. Gene. 2015 Feb 1;556(1):51-60.
4) Spichal, M., S. Herbert, A. Cournac, C. Zimmer, R. Koszul, and E. Fabre. (2015). Evidence for actin dual roles in regulating chromosome organization and dynamics in yeast J. Cell Science (revision).
B) COMMUNICATIONS
2014
1) Keystone meeting Mobile DNA, Santa Fe, USA. An essential role of Pol III subunit AC40 in Ty1 integration targeting, P. Lesage (oral) ?
2) 5th International Conference on Retroviral Integration, Asilomar, USA. An essential role for an RNA polymerase III subunit in determining sites of Ty1 retrotransposon integration. P. Lesage (oral) ?
3) FEBS-EMBO 2014 joint conference for life science. An essential role of Pol III subunit AC40 in Ty1 integration targeting, A. Bridier-Nahmias and P. Lesage (Poster)
4) Levures Modèles outils LMO11, Bordeaux: An essential role of Pol III subunit AC40 in Ty1 integration targeting. A. Bridier-Nahmias (oral)?
5) GDR Les Eléments Génétiques Mobiles : du mécanisme aux populations, une approche intégrative. Paris. An essential role of Pol III subunit AC40 in Ty1 integration targeting. A. Bridier-Nahmias (oral).

2015
1) Colloque des 3R. Presqu’ile de Giens. An RNA polymerase III subunit determines sites of retrotransposon integration, A. Bridier-Nahmias (oral).

CONTEXTE SCIENTIFIQUE ET OBJECTIFS
Les rétroéléments (rétrovirus et rétrotransposons à LTR (LTR-RT)) se répliquent par transcription inverse de leur génome ARN en un ADNc, ensuite intégré dans le chromosome de la cellule hôte, réaction catalysée par l'intégrase des rétroélements. Une réplication est productive si l’ADNc transite à travers le cytoplasme, traverse avec l'intégrase la membrane nucléaire et accède à son site d'intégration qui permet la transcription des gènes viraux. Si des progrès importants ont été accomplis dans l’étude du trafic des particules virales dans le cytoplasme, les événements qui se produisent à l'interface entre le cytoplasme et le noyau, jusqu'à leur intégration dans l'ADN de l'hôte, restent largement inconnus. Cette question est fondamentale puisque l'intégration de l’ADNc est essentielle à une infection productive et la persistance virale. Le but du projet est de poser, à différents niveaux, la même question fondamentale de l'interaction entre la réplication de rétroéléments et l'architecture nucléaire, de l'import nucléaire virale à son intégration génomique.
DESCRIPTION DU PROJET/METHODOLOGIE
Les LTR-RT sont omniprésents dans les génomes eucaryotes. L’étude des LTR-RT de levure a contribué à une meilleure connaissance de la biologie des rétrovirus. C’est pourquoi, nous utiliserons le LTR-RT Ty1 de levure, comme modèle d’étude.
L'intégration des rétroéléments n’est pas aléatoire in vivo, et leur spécificité d’intégration dans le génome de la cellule hôte dépend en partie de facteurs de transcription.
Notre premier objectif est d'étudier l'influence de la transcription sur le choix du site d'intégration de Ty1:
- en reconstituant des systèmes d’intégration in vitro sophistiqués, permettant d’étudier l’intégration de Ty1 couplée à une transcription active;
- par des stratégies novatrices afin d'identifier in vivo, de nouveaux cofacteurs de Ty1, impliqués dans l'import nucléaire et l'intégration, en particulier ceux présents au site d’intégration.
Dans le noyau, les chromosomes et les loci individuels affichent des positions préférentielles dynamiques et non aléatoires, qui semblent influencer les processus liés au métabolisme de l'ADN.
Notre deuxième objectif est de déterminer l'impact de l'architecture des chromosomes dans l'intégration rétrovirale, ainsi que l'influence des insertions rétrovirales sur l'organisation tridimensionnelle du noyau:
- en utilisant les outils les plus modernes pour suivre la position des loci Ty1 dans les cellules vivantes et cartographier leur position en deux dimensions dans l'espace nucléaire, et pour comparer la position de plusieurs loci avant et après intégration de Ty1.
Les protéines et l’ADNc des rétrovirus s'accumulent au centrosome, mais la nature des événements qui se produisent à cet organite et leur impact sur l'import nucléaire et l'intégration est inconnue.
Notre troisième objectif est de décrypter la contribution du spindle pole body (le centrosome de levure) et du réseau de microtubules dans la réplication de Ty1:
- en analysant la localisation de Ty1 et des protéines du SPB par microscopie à fluorescence hautement résolutive ;
- en déterminant si un SPB fonctionnel est nécessaire pour la réplication de Ty1, par des approches génétiques et génomiques.
RESULTATS ATTENDUS
- identifier de nouveaux partenaires cellulaires Ty1;
- décrypter au niveau moléculaire le lien entre la transcription et le processus d'intégration;
- déterminer l'impact de l'organisation tridimensionnelle des chromosomes sur le processus d'intégration;
- acquérir des connaissances sur la contribution du SPB dans la réplication de ty1.
Ce projet devrait aussi ouvrir de nouvelles pistes pour étudier les interactions entre les mécanismes cellulaires et les rétrovirus de mammifères, et avoir donc des implications importantes en thérapie clinique pour le traitement des infections rétrovirales et pour le développement de nouveaux vecteurs rétroviraux pour la thérapie génique.