Induction de mort cellulaire par stimulation peptidique du récepteur CD47: nouvelle stratégie thérapeutique pour le traitement de la leucémie lymphoïde chronique – PeptiDeath

Dans un premier temps, à partir d’un peptide dérivé de la TSP-1 connu par la bibliographie (nommé 4N1K), nous avons désigné et généré par synthèse chimique des peptides stables dans le sérum humain. Ensuite, nous avons testé leur affinité par le récepteur CD47 (équipe du Dr. Philippe Karoyan). Nous avons ainsi sélectionné trois peptides actifs : PKT1, PKHB1, and PKHB3.
Dans une deuxième partie de notre travail, l’efficacité de ces nouveaux peptides a été évaluée par qPCR, cytofluorimétrie, et des méthodes de biologie moléculaire et cellulaire sur des lymphocytes B purifiés d'un large panel de patients atteints de LLC, incluant des cellules de patients résistants aux chimiothérapies actuelles (équipe du Dr. Santos A Susin).
Finalement, le peptide qui a donné la meilleure réponse d’induction de MCP in vitro sur les lymphocytes B de LLC, PKHB1, a été testé in vivo chez la souris dans des un modèle de xénogreffe tumorale (équipe du Dr. Pierre Launay).

A partir d’échantillons de sang de 80 patients atteints de LLC dont certains avec des formes agressives et rebelles à toute thérapeutique, nous avons fait des tests génétiques et moléculaires qui démontrent que le ciblage du CD47 par des peptides dérivés de la thrombospondine-1 peut tuer efficacement les cellules B du clone leucémique. Ceci inclut les formes particulièrement résistantes, dont celles qui ont un dysfonctionnement du gène TP53, alors que les lymphocytes B normaux résiduels et les lymphocytes T des patients sont préservés. Des études complémentaires ont révélé la cause de la réponse différentielle aux peptides agonistes du CD47 des lymphocytes B sains et des cellules B leucémiques. L’engagement du récepteur CD47 par les peptides agonistes provoque dans les cellules de LLC une activation persistante de la phospholipase C gamma-1 (PLC[gamma]1), une protéine qui est retrouvée surexprimée de manière significative et sélective dans la LLC. La phosphorylation de la PLC[gamma]1 au niveau de la tyrosine 183 entraine l’activation d’une voie de mort cellulaire indépendante des caspases médiée par le calcium. De plus, en utilisant un modèle de xénogreffe de cellules de LLC sur des souris NOD/scid, nous avons démontré que l’injection de peptides agonistes du récepteur CD47 réduit significativement la masse tumorale, sans entrainer de toxicité sanguine, hépatique ou rénale.

L’ensemble de notre travail a permis de développer des peptides agonistes du CD47, stables dans le sérum humain, qui entrainent une mort cellulaire programmée caspase-indépendante des cellules de LLC, révélant les mécanismes moléculaires qui sous-tendent ce phénomène, en particulier la surexpression de la protéine PLC[gamma]1. Ce travail ouvre des perspectives très encourageantes pour explorer une nouvelle voie thérapeutique capable de juguler les formes les plus résistantes de LLC.

Articles
PLoS Medicine, vol 12, pp. e1001796. (Impact Factor : 14,4)

Brevets
1.- New prognostic method for patients suffering of a cancer. PCT/EP2014/077335.
2.- Method and pharmaceutical composition for the use in the treatment of cancer. PCT/EP2013/061727 (WO2013182650 A1)..

La mort cellulaire programmée (MCP) est essentielle pour le développement et le maintien de l’homéostasie des cellules immunitaires. Des aberrations dans les voies de signalisation de la MCP peuvent entraîner de nombreuses pathologies et sont fréquentes dans les cellules cancéreuses. Ces changements cellulaires conduisant à une inhibition des voies de MCP jouent un rôle essentiel dans le développement tumoral. Ainsi, l’étude de l’activation des voies de MCP pourrait fournir de nouvelles avancées dans le domaine de la résistance aux traitements et faciliter le développement de nouvelles thérapies anticancéreuses.

La mort cellulaire programmée chez les mammifères repose principalement sur une cascade protéolytique impliquant des protéases à cystéines: les caspases. Un arsenal thérapeutique ciblant les caspases devrait pouvoir pallier un défaut de MCP. Malheureusement, la majorité des études concernant de telles molécules sont encore en développement pré-clinique en raison de leur faible efficacité Ceci suggère que le blocage de la voie caspasique n’empêche pas toute la MCP et qu’il existe d’autres voies de mort alternatives indépendantes des caspases. L’activation de ces voies caspases-indépendantes ouvre de nouvelles perspectives de traitements thérapeutiques jusqu’alors inexplorées par la communauté scientifique et l’industrie pharmaceutique.

La Leucémie Lymphoïde Chronique (LLC), exemple parfait de pathologie humaine causée par un déséquilibre entre prolifération et mort cellulaire programmée est la leucémie la plus fréquente chez l’adulte dans les pays occidentaux. La LLC reste incurable notamment en raison de rechutes inévitables des patients suite à l’apparition de résistances aux thérapies classiques utilisées. Ces traitements induisent une toxicité dans les cellules de LLC via des mécanismes dépendant des caspases et donnent des résultats variables selon les patients. En effet, les cellules B leucémiques présentent des altérations moléculaires (par exemple : mutation TP53 et ATM) qui les rendent particulièrement résistantes à ces traitements. Pour ces raisons, le développement de nouvelles stratégies permettant d’induire une MCP indépendante des caspases pourrait améliorer le traitement de la LLC.

Nous avons ainsi montré que la liaison de CD47 par un peptide soluble (appelé 4N1K) induit une MCP caspase-indépendante de manière rapide (1h après traitement) et avec une meilleure efficacité sur les cellules de LLC que sur les cellules B normales. Et cela même dans les cellules de LLC provenant de patients réfractaires aux traitements classiques. De plus, nos résultats récents montrent qu’il est possible d’augmenter l’activité biologique d’induction de MCP du 4N1K en augmentant sa stabilité métabolique (peptide PKHB-1).
Notre programme de recherche prévoit la production d’une série de peptides solubles qui élimineraient spécifiquement les cellules de LLC, y compris les cellules B présentant un gène TP53 non fonctionnel (patients chimio-résistants). Ces peptides seront testés à la fois in vitro (sur un large échantillon de lymphocytes B purifiés) et in vivo sur un modèle murin de xénogreffe tumorale.

Pour atteindre nos objectifs, nous avons réunis un groupe compétant avec des spécialistes de la MCP caspases-indépendante (SA Susin, Centre de Recherche des Cordeliers) et de la LLC (H Merle-Béral, Hôpital Pitié-Salpetrière) mais également des spécialistes de la synthèse peptidique (P Karoyan, ENS-Paris) et des modèles de xénogreffe chez la souris (P Launay, UMRS699). Ce projet scientifique développé en partenariat entre biologistes, cliniciens et chimistes, où chacun peut profiter de l’expertise de l’autre, permettra une diffusion rapide et efficace de la recherche du laboratoire au chevet du patient.