Blanc SVSE 8 - Blanc - SVSE 8 - Biochimie, biologie moléculaire et structurale

Caractérisation structurale et fonctionnelle des Sulfs humaines – SULF

Sulfs : des modulateurs du paysage glycanique de la surface cellulaire

Les enzymes de la famille des Sulfs sont des régulateurs majeurs de l’activité de polysaccharides complexes, les héparanes sulfate, et sont ainsi impliqués dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques. Ce projet vise à étudier les propriétés structurales et fonctionnelles des Sulfs, afin de comprendre les mécanismes fondamentaux associés à l’activité de ces enzymes, et d’ouvrir de nouvelles perspectives pour le développement d’approches thérapeutiques basées sur leur inhibition.

Caractérisation structurale et fonctionnelle des enzymes HSulfs

Les héparanes sulfate (HS) sont des polysaccharides complexes présents en abondance à la surface des cellules et dans les matrices extra-cellulaires. De par leur positionnement stratégique à l’interface entre la cellule et son micro-environnement, et leur capacité à fixer et moduler l’activité d’un très grand nombre de protéines, les HS sont impliqués dans la plupart des grands processus cellulaires. <br /><br />Les multiples fonctions biologiques des HS sont liées à la présence au sein du polysaccharide de régions spécialisées (les domaines S), caractérisées par leur séquence saccharidique et leur profil de sulfatation, et contenant l’information structurale nécessaire à la reconnaissance de leurs ligands. L’expression de tels motifs est étroitement contrôlée lors de la biosynthèse des HS, mais également par l’action d’enzymes de dégradation qui vont venir apporter des modifications structurales supplémentaires, directement à la surface cellulaire. Parmi elles, les Sulfs constituent une famille de sulfatases récemment identifiée, qui jouent un rôle important dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques.<br /><br />Cependant, malgré l’intérêt qu’elles représentent, ces enzymes demeurent très mal connues. L’objectif de ce projet est de réaliser une étude détaillée des propriétés structurales et fonctionnelles des deux formes humaines de ces enzymes, HSulf-1 et HSulf-2. Les résultats obtenus devraient fournir des informations précieuses sur cet important mécanisme de régulation de l’activité des HS et sur l’implication de ces polysaccharides dans de nombreuses fonctions biologiques. Par ailleurs, ils devraient établir les bases structurales pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques basées sur une inhibition des HSulfs.

Les méthodes et approches qui seront développées dans ce projet s’articulent autour de 6 objectifs principaux.
1- le développement d’un système d’expression des HSulfs, basé sur l’utilisation d’un vecteur d’expression récemment breveté (collaboration Philippe Desprès, Institut Pasteur), et de cellules mammifères HEK adaptées à la culture en suspension et en absence de sérum (HEK293, Invitrogen). Des banques d’oligosaccharides seront également préparées, par fragmentation enzymatique de chaînes d’HS, purification et caractérisation des fragments générés. Ces banques nous permettront de disposer d’une large variété de structures pour nos mesures d’interaction et nos tests d’activité enzymatique.
2- la détermination des caractéristiques dynamiques et structurales du processus de reconnaissance enzyme/ligand par des techniques biophysiques et biochimiques. L’interaction HS/HSulfs sera notamment analysée par résonance plasmonique de surface (SPR) afin d’en caractériser les aspects cinétiques, et les acides aminés impliqués dans l’interaction seront identifiés grâce à une méthode d’analyse des complexes protéine/HS récemment développée au laboratoire.
3- l’analyse par des méthodes de séquençage d’oligosaccharide de l’activité enzymatique des Hsulfs et de ses conséquences sur des structures oligosaccharidiques de type « domaine S » d’HS.
4- l’étude de la régulation du Fibroblast Growth Factor-2 (FGF-2) par les HSulfs et l’identification de profils de 6-O-sulfatation nécessaires à l’activation de ce facteur de croissance.
5- la résolution de la structure de Hsulf, seule ou en complexe avec son substrat, par cristallographie aux rayons X.
6- la recherche d’inhibiteurs par criblage automatisé de chimiothèques.

Suivant le calendrier des tâches décrit dans le projet, les 6 premiers mois de notre travail ont essentiellement porté sur la mise en place d’un système d’expression de HSulf-2. Des étapes de clonage réalisées précédemment ont permis d’ajouter à l’enzyme une étiquette à son extrémité N-terminale, afin de faciliter sa détection et d’améliorer les rendements de production (collaboration Philippe Després, Institut Pasteur). L’expression a été réalisée en cellules mammifères HEK cultivées en suspension et en absence de sérum. Des tests d’expression ont été effectués et ont confirmé que l’enzyme était bien produite et correctement secrétée dans le milieu de culture.

Un protocole de purification de HSulf-2 a ensuite été développé et nous a permis d’obtenir une protéine fonctionnelle, pure à ~95%. La qualité de la préparation de protéine a été validée par spectrométrie de masse, séquençage N-terminal, microscopie électronique et MALS/DLS. L’utilisation de la TEV afin d’éliminer les étiquettes par protéolyse a également été confirmée. En parallèle, le clonage et la transfection de cellules HEK pour l’expression de HSulf-1 ont été réalisés avec succès, ainsi que des expériences de mutagénèse dirigée visant à obtenir des mutants catalytiques pour ces 2 enzymes. Enfin, la purification d’oligosaccharides issus d’HS et d’héparine a été entreprise.

De par leur implication dans un très grand nombre de processus physiologiques et pathologiques, les Sulfs présentent un intérêt évident en recherche fondamentale et appliquée. Cependant, l’étude de ces enzymes et de leurs mécanismes d’action demeure extrêmement difficile à mettre en œuvre et, de ce fait, peu d’informations sont actuellement disponibles, tant au niveau structural que fonctionnel.

Le programme de travail décrit dans le cadre de ce projet vise à obtenir des informations nouvelles sur ces enzymes, basées sur le développement d’approches originales et multidisciplinaires. Ainsi, la génération de banques oligosaccharidiques représente un outil unique dont la mise en place nous donnera accès à un panel d’échantillons représentatif du haut degré de diversité structurale des HS. L’analyse des caractéristiques dynamiques (affinités et paramètres cinétiques de la fixation à différents substrats) et structurales (motifs saccharidiques et protéiques impliqués) de l’interaction HSulf/HS permettra de mieux appréhender les mécanismes de reconnaissance enzyme/ligands et le processus de désulfatation du polysaccharide. Ces approches de caractérisation in vitro seront complétées par une étude fonctionnelle, sur le modèle particulièrement pertinent du FGF-2. En parallèle, nous nous engageons à relever le défi majeur que représente la résolution de la structure des HSulfs par cristallographie aux rayons X. Bien qu’extrêmement complexe et délicate, l’obtention de données structurales précises sur ces enzymes représenterait une avancée considérable dans le domaine. Enfin, nous nous proposons de développer un programme de recherche d’inhibiteurs des HSulfs par criblage automatisé de chimiothèques. L’identification de molécules biologiquement actives par cette approche systématique devrait permettre de définir les bases structurales pour le développement d’inhibiteurs en vue d’éventuelles applications thérapeutiques.

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Les héparanes sulfate (HS) sont des polysaccharides complexes présents en abondance à la surface des cellules et dans les matrices extra-cellulaires. De par leur positionnement stratégique à l’interface entre la cellule et son micro-environnement, et leur capacité à fixer et moduler l’activité d’un très grand nombre de protéines, les HS sont impliqués dans la plupart des grands processus cellulaires.

Les multiples fonctions biologiques des HS sont liées à la présence au sein du polysaccharide de régions spécialisées (les domaines S), caractérisées par leur séquence saccharidique et leur profil de sulfatation, et contenant l’information structurale nécessaire à la reconnaissance de leurs ligands. L’expression de tels motifs est étroitement contrôlée lors de la biosynthèse des HS, mais également par l’action d’enzymes de dégradation qui vont venir apporter des modifications structurales supplémentaires, directement à la surface cellulaire. Parmi elles, les Sulfs constituent une famille de sulfatases récemment identifiée. Le niveau de désulfatation des HS catalysée par les Sulfs est relativement limité. Cependant, en agissant spécifiquement sur les profils de 6-O-sulfatation des domaines S, ces enzymes altèrent de manière radicale la capacité du polysaccharide à interagir avec un très grand nombre de ses ligands (tels que des facteurs de croissance, des chimiokines et des morphogènes…) et jouent donc un rôle important dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques.

Malgré l’intérêt que représentent les Sulfs pour l’ensemble de ces phénomènes, ces enzymes demeurent très mal connues. Récemment, nous avons montré que ces enzymes catalysaient la désulfatation des HS en suivant un mécanisme orienté et processif. L’objectif de ce projet est de poursuivre ces travaux et de réaliser une étude détaillée des propriétés structurales et fonctionnelles des deux formes humaines de ces enzymes, HSulf-1 et HSulf-2. Pour cela, nous proposons d’utiliser une approche intégrée et multidisciplinaire, basée sur l’expertise scientifique et la complémentarité des personnes impliquées, ainsi que sur la qualité des moyens techniques disponibles à l’Institut de Biologie Structurale (IBS). Les principaux aspects de notre travail correspondront à la mise en place d’un système d’expression des HSulfs permettant la production en quantité importante d’enzymes purifiées, et la génération de banques saccharidiques qui fourniront les substrats nécessaires aux études fonctionnelles et structurales, l’analyse détaillée des caractéristiques dynamiques et structurales du processus de reconnaissance de substrat, l’étude de l’activité sulfatase des HSulfs au niveau structural (effets sur des motifs saccharidiques de type domaine S) et fonctionnel (régulation de l’activité du FGF-2), la résolution de la structure des HSulfs par cristallographie aux rayons X et la recherche d’inhibiteurs de l’enzyme. Les résultats obtenus devraient fournir des informations précieuses sur cet important mécanisme de régulation de l’activité des HS et sur l’implication de ces polysaccharides dans de nombreuses fonctions biologiques. Par ailleurs, ils devraient établir les bases structurales pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques basées sur une inhibition des HSulfs.

Coordination du projet

Romain VIVES (Institut de Biologie Structurale UMR5075) – vives@ibs.fr

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

IBS Institut de Biologie Structurale UMR5075

Aide de l'ANR 199 900 euros
Début et durée du projet scientifique : janvier 2013 - 36 Mois

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