Compartimentation redox du GSH dans la cellule eukaryote et son role dans la regulation de l’homéostase redox du réticulum endoplasmique – ERRed

Questions
La thioredoxine est prééminente dans le contrôle thiol-redox de levure, et le glutathion (GSH) a une fonction essentielle dans le métabolisme du fer. Paradoxalement aucune fonction redox spécifique n’est attribuée au GSH. Comment approcher cette question? La génétique a été exploitée. La biochimie et l’imagerie ne sont pas praticables en raison de la taille du GSH. L’approche spécifique de compartiments a en revanche été utile: les bio-moniteurs redox du GSH ont montré des variations extrêmes du potentiel redox du GSH (EGSH) du réticulum endoplasmique (RE) ou il est très oxydé, jusqu'au cytosol ou il est très réduit. Cependant, ils ignorent comment ces différences sont maintenues. Le EGSH oxydé du RE et de l’espace intermembranaire de la mitochondrie (IMS) sont liées à une oxydation intense des thiols in situ, mais si le GSH diffusait librement, il n’y aurait pas de gradients. Réciproquement, si le la régulation du GSH est compartimentée, sachant que la GSH reductase n’est que dans le cytosol et la matrice mitochondriale, comment est réduit le GSSG généré dans le RE et l’IMS ? Est-il acheminé ailleurs?
La question clé est donc de savoir comment sont maintenus les gradients de EGSH entre compartiments, particulièrement importante dans le RE, ou le repliement des protéines par oxydation requière l’oxydation et la réduction des thiols. Dans le RE, la formation des ponts disulfures est comprise, mais pas la source de réduction. Le GSH est premier candidat, mais sa régulation dans le RE est inconnue. La coexistence de deux réactions opposées —oxydation et réduction de thiols— dans le RE est probablement liée à des fonctions moléculaires de la protéine disulfure isomérase (PDI) liées à son interaction avec le GSH restant à élucider?

Objectif général
Nous questionnons les mécanismes de maintien des gradients de EGSH entre compartiments, en considérant qu’ils sont liés aux vitesses d’oxydation et réduction du GSH, et aux flux de GSH/GSSG vers/hors compartiments. Nous étudierons si et comment le GSH trafique entre compartiments, puis nous concentrerons sur rôle du GSH dans le RE de façon intégrée à son homéostasie redox.

Innovations
a) Trafic du GSH
Nous avons établi chez la levure un système pour évaluer les flux de GSH entre compartiments. Il comporte le moniteur redox du GSH rxYFP, et des cellules expriment le transporteur du GSH/GSSG de la membrane plasmatique, dans lesquelles les niveaux totaux de GSH/GSSG peuvent être augmentés instantanément de 0 > 10 fois. En accord avec l’équation de Nernst, EGSH —donné par rxYFP— est une fonction du rapport GSH/GSSG et de la concentration absolue de GSH. Ainsi la variation de EGSH dans les compartiments lors de l’augmentation de GSH total permet de suivre sa dynamique de distribution cellulaire. Ce système offre un outil unique pour moduler l’environnement redox du RE.
b) Une approche ciblée pour quantifier l’oxydation des thiols
Nous développerons une nouvelle approche de protéomique ciblée pour accéder à l’état redox de protéines représentatives du RE et de l’IMS, combinant notre technique, OcSILAC à l’identification ciblée des peptides par «Selected Reaction Monitoring », et permettant des expériences itératives.

Objectifs spécifiques
L’objectif 1 utilise le système HGT1, et la modulation des voies redox pour décrire la dynamique de distribution du GSH, de prédire la présence de transporteurs, et de tester si le stress du RE active le trafic de GSH dans le RE.
L’objectif 2 utilise le système HGT1 dans un crible haut débit et une sélection génétique, pour identifier des systèmes de transport du GSH du RE et de sa régulation redox.
L’objectif 3 combine des mutations de PDI, le système HGT1 et la protéomique redox afin d’élucider comment le pouvoir réducteur du GSH est acheminé à PDI, Ero1, puis aux substrats du RE.

Retombées
Ce projet contribuera à élucider les fonctions redox du GSH et la régulation redox du RE de levure applicable aux mammifères.