La quinolinate synthase, une enzyme fer-soufre cible d’agents antibactériens – NADBIO

Des analogues de substrats et de potentiels intermédiaires ont été utilisés comme sondes pour décortiquer le mécanisme réactionnel. Le rôle du centre Fe-S dans la catalyse en tant qu’acide de Lewis a été évalué en combinant les spectroscopies Mössbauer et RPE en utilisant les substrats naturels de NadA et des analogues. La structure tridimensionnelle de NadA avec son centre Fe-S permettant d’obtenir des informations sur le site actif de l’enzyme, et ainsi nous éclairer sur le mécanisme et nous aider à la conception d’inhibiteurs a été obtenue par cristallographie aux rayons X. La technique de criblage à haut débit sur E. coli a été utilisée
pour trouver des molécules à activité anti-NadA in vivo. En parallèle, une approche plus rationnelle avec l’utilisation d’analogues de substrats et d’intermédiaires réactionnels a été entreprise. Par l’utilisation de ces diverses approches (chimie, biochimie, cristallographie, spectroscopie et biologie) nous avons avancé dans la compréhension de la voie de biosynthèse du NAD chez les procaryotes et dans la conception de nouveaux agents anti-bactériens antiquinolinate synthase.

1- Obtention du premier inhibiteur de la quinolinate synthase : l’acide 4,5 dithiohydroxyphtalique (DTHPA), que nous avons montré comme étant un bon inhibiteur de la quinolinate synthase (NadA) in vitro et in vivo sur bactéries en culture juste avant le démarrage de l’ANR (Publication 1). Obtention également de dérivés du DTHPA comme inhibiteurs de NadA.
2- Obtention de la première structure RX de NadA sous une forme active (avec son centre Fe-S) à 1.6 Å de résolution (Publication 2).
3- Elimination de l’un des mécanismes proposés pour la formation du QA.
Démonstration que le QA est formé par condensation directe du DHAP avec l’IA (Publication 3). Obtention d’un intermédiaire par cristallographie aux rayons-X (Publication 4).

-

1- Studies of inhibitor binding to the [4Fe-4S] cluster of quinolinate synthase. Chan A, Clémancey M, Mouesca JM, Amara P, Hamelin O, Latour JM, Ollagnier de Choudens S. Angew Chem Int Ed Engl. 2012; 51:7711-4.
2- The crystal structure of Fe4S4 quinolinate synthase unravels an enzymatic dehydration mechanism that uses tyrosine and a hydrolase-type triad. Cherrier MV, Chan A, Darnault C, Reichmann D, Amara P, Ollagnier de Choudens S, Fontecilla-Camps JC. J Am Chem Soc. 2014 Apr 9; 136(14):5253-6.
3- Dual Activity of Quinolinate Synthase: Triose Phosphate Isomerase and Dehydration Activities Play Together To Form Quinolinate. Reichmann D, Couté Y, Ollagnier de Choudens S. Biochemistry. 2015 Oct 27; 54(42):6443-6.
4- Crystal Structures of Quinolinate Synthase in Complex with a Substrate analog, its First Condensation Intermediate and Substrate-derived Product.
Volbeda A, Darnault C, Renoux O, Reichmann D, Amara P, Ollagnier de Choudens S, C. Fontecilla-Camps J. J Am Chem Soc. 2016 (en révision)

Ouvrage : Fe4S4 Quinolinate Synthase (NadA).
Cherrier MV, Ollagnier de Choudens S, Fontecilla-Camps JC
Encyclopedia of Inorganic and Bioinorganic Chemistry 2016 (in press).

Le Nicotinamide Adénosine Dinucléotide (NAD) est synthétisé chez tous les organismes vivants à partir de l’acide quinolinique (QA). Cependant la biosynthèse de ce dernier diffère selon les organismes. Chez la plupart des eucaryotes il est produit via la dégradation du tryptophane alors que chez les procaryotes il est synthétisé par l’action successive de deux enzymes: la L-aspartate oxydase (NadB) qui permet la formation d’iminoaspartate et la quinolinate synthase (NadA) qui permet la condensation de l’iminoaspartate avec la dihydroxyacétone-phosphate pour former l’acide quinolinique. En plus de la voie principale, la plupart des organismes possèdent une voie dite de secours permettant de synthétiser du NAD à partir de divers métabolites de sorte à maintenir une concentration de NAD adéquate pour le métabolisme cellulaire. Chez certains micro-organismes pathogènes comme Mycobacterium leprae et Helicobacter pylori, responsables respectivement de la lèpre et de certains cancers gastriques, cette voie de secours n’est pas présente. Ceci fait de NadA une enzyme essentielle chez ces bactéries et par conséquent une cible particulièrement attractive pour le développement de nouveaux antibactériens et ceci d’autant plus qu’elle est absente chez l’homme qui synthétise le QA par dégradation du tryptophane. A ce jour il n’existe pas d’inhibiteur(s) de la quinolinate synthase. NadA est une métalloenzyme universelle dont le centre métallique, un agrégat de type 4Fe/4S coordonné par trois résidus cystéine, joue un rôle essentiel dans la catalyse. La formation de l’acide quinolinique, précurseur du cycle pyridine du NAD, constitue la seule étape dans la voie de biosynthèse du NAD pour laquelle le mécanisme est inconnu. Deux mécanismes ont été proposés dans la littérature pour la réaction catalysée par NadA, mais aucun n’a été vérifié et le rôle du centre 4Fe/4S dans celle-ci n’a pas été démontré. Deux raisons possibles: la complexité de la réaction qui est bi-moléculaire et la sensibilité du centre 4Fe/4S de la protéine à l’oxygène. Décortiquer le mécanisme moléculaire de formation de l’acide quinolinique représente ainsi un défi en chimie biologique. L’objectif de ce projet est justement de comprendre au niveau moléculaire le mécanisme enzymatique de la quinolinate synthase et de trouver des molécules de synthèse permettant de mieux l’étudier et de l’inhiber afin de concevoir des antibactériens contre M. leprae et H. pylori. Ceci sera possible par un échange permanent d’informations entre chimistes, biochimistes, biophysiciens, microbiologistes, cristallographes et technologues. Plus précisément, des analogues de substrats et de potentiels intermédiaires seront utilisés comme sondes pour décortiquer le mécanisme réactionnel. Leur capacité à inhiber l’enzyme NadA in vitro pourra être mise à profit pour la conception d’agents antibactériens. Le rôle du centre fer-soufre dans la catalyse en tant qu’acide de Lewis sera évalué en combinant la spectroscopie RPE classique et avancée à la spectroscopie Mössbauer en utilisant les substrats naturels de l’enzyme et les analogues. La résolution de la structure cristallographique de NadA contenant son centre Fe/S nous permettra d’obtenir des informations sur le site actif de l’enzyme, ce qui nous éclairera sur le mécanisme et nous aidera à la conception d’inhibiteurs. La technique de criblage à haut débit sur Escherichia coli sera utilisée comme principale approche pour trouver des molécules à activité anti-quinolinate synthase in vivo. On confirmera l’action inhibitrice spécifique de ces molécules in vitro sur NadA de M. leprae et H. pylori puis in vivo sur ces pathogènes en collaboration avec l’Institut Pasteur et l’Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne. Nous attendons de ce projet la compréhension de la voie de biosynthèse du NAD dans sa totalité chez les procaryotes, via la formation de l’acide quinolinique et la mise au point de nouveaux agents anti-bactériens anti-NadA.