Identification du dialogue moléculaire entre la division du chloroplaste et le métabolisme de l’amidon – CaSta DivA

Ce projet sera entrepris selon une approche qui mêlera des méthodes biochimiques, de biologie moléculaire et de génétique. Ainsi la quantité d’amidon, la structure, la taille et le nombre de grains accumulés dans les lignées affectées pour la division des plastes seront établis. Puis nous éclaircirons le lien unissant division du plaste et processus d’initiation du grain d’amidon par des approches génétiques basées sur la combinaison de mutations (entre des mutants de la voie amidon et des mutants de la machinerie de division de l’organelle). Nous établirons également la liste des partenaires interagissant avec SS4 par l’intermédiaire d’une technologie double hybride optimisée en utilisant la protéine SS4 comme appât. Nous confirmerons les interactions observées par une approche classique de double hybride et d’autres techniques comme la coimmunoprécipitation. Les complexes protéiques seront localisés dans les feuilles ou les racines et la dynamique de la localisation des protéines FtsZ, ARC et SS4 sera déterminée in vivo dans les feuilles et les racines. Enfin, nous éclaircirons la fonction de SS4 dans le processus d’initiation de la synthèse d’amidon par une double analyse basée sur (i) l’étude des paramètres cinétiques de l’enzyme et des produits de synthèse ; (ii) l’expression chez le mutant nul ss4- de formes recombinantes de la SS4 ayant des délétions du motif d’interaction protéine-protéine ou des modifications ciblées des sites catalytiques fortement conservés à travers toutes les enzymes de la même famille.

Ce projet doit permettre d’établir le processus d’initiation de la synthèse de l’amidon chez les plantes. Il doit permettre aussi de mieux comprendre les liens entre la division du plaste et le métabolisme de l’amidon qui s’y déroule. Comprendre ces processus biologiques revêt non seulement un intérêt cognitif mais aussi un intérêt appliqué. En effet, l’efficacité de transformation par voie chimique de l’amidon après son extraction de la plante dépend beaucoup de la taille des grains. Il en va de même des rendements d’extraction. La maîtrise des processus d’initiation de synthèse de l’amidon permettra de définir les approches à mettre en œuvre avec les plantes de grande culture pour contrôler la taille des grains d’amidon selon l’usage qui en sera fait. Ces travaux s’intègrent en partie dans les projets de recherche d’IFMAS, Institut Français des Matériaux Agrosourcés. Cet institut financé dans le cadre des Investissements d’Avenir (programme des Instituts d’Excellence en Energies Décarbonées) regroupe des équipes de recherche publiques et des industriels et a pour objectif de produire des plastiques à partir d’amidon évitant ainsi l’utilisation des dérivés du pétrole. Une des clés de la transformation de l’amidon en plastique repose sur sa modification chimique qui sera d’autant plus efficace que les grains d’amidon seront petits. L’objectif sera donc de multiplier le nombre de grains de petite taille dans les plantes pour répondre aux besoins de transformation post-extraction sans pour autant mettre en péril les rendements de productions des plantes et des procédés d’extraction.

Les problématiques abordées au cours de ce projet sont d’autant plus importantes que l’amidon représente une matière première largement utilisée dans les industries alimentaire et non-alimentaire. L’amidon est utilisé pour la production de plastiques, d’adhésifs, de stabilisants de peinture, d’excipients et peut être transformé en bioéthanol. Il est largement utilisé dans l’industrie agro-alimentaire pour son pouvoir gélifiant et stabilisant. Contrôler la taille des grains selon les applications représenterait un atout majeur pour les différentes applications industrielles. Ce projet permettra de définir les voies de sélection des plantes pour répondre aux besoins.

Des résultats intéressants ont été obtenus depuis le début du projet. Il s’agit en particulier de l’expression de SS4 dans E. coli et les perturbations que cela entraine au niveau de la division cellulaire. La sélection du gène VAR1 et du mutant correspondant représente aussi un résultat intéressant. Cependant nous avons encore besoin de confirmation avant que ces résultats ne deviennent réellement marquants. C’est ce à quoi nous nous attacherons lors de la 2 partie du projet CaSta DivA en particulier en exprimant une forme adaptée de SS4 dans E. coli et l’analyse d’une lignée mutante du gène VAR1 sélectionnée chez A. thaliana.
Ces résultats pourront être transférés vers les programmes de l’IEED IFMAS (Institut Français des Matériaux AgroSourcés) qui vient de voir le jour dans le cadre du PIA sur le site de Lille1.

Notre équipe à l'UGSF a mis en évidence le fait que chez l’algue verte unicellulaire Ostreococcus tauri, la division de l’unique grain d’amidon était concomitante de celle de l’unique plaste. Nous avons interprété ce phénomène par la nécessité de répartir l’amidon entre les deux structures filles afin d’assurer la présence de molécules initiatrices de la synthèse de l’amidon et ainsi préserver la continuité du métabolisme de l’amidon. La préexistence d’une structure de type amidon semble être impérative chez O. tauri dans la mesure où il a été impossible de faire disparaître totalement l’amidon de cet organisme même lorsque les cellules ont été placées plusieurs jours à l’obscurité totale. Bien que la situation soit différente chez les plantes supérieures (absence apparente du contrôle de la répartition des grains d’amidon dans les structures filles après division), la question du contrôle de l’initiation de la synthèse du grain d’amidon reste toujours posée pendant la division du plaste. La présence de grains d’amidon denses, insolubles dans l’eau et semi-cristallins pourrait représenter une gêne insurmontable lors de la fission du plaste par l’anneau de constriction. Par ailleurs, toujours à l’UGSF, nous avons démontré le rôle primordial de la protéine SS4 dans le processus d’initiation de la synthèse de l’amidon chez A. thaliana. Un motif "coiled-coil" de type EzrA a été mis en évidence dans la région N-terminale de SS4. EzrA est un régulateur bactérien de la formation de l’anneau de division cellulaire formé, entre autres, par la protéine FtsZ. Ceci suggère que SS4 pourrait être impliquée dans le processus coordonnant la division des plastes et le contrôle de l’initiation de la synthèse des grains d’amidon chez les plantes supérieures. L’existence d’une telle relation est renforcée par nos premières observations qui montrent que les mutants KO ou les surexpresseurs de la protéine végétale FtsZ1 contiennent un seul plaste par cellule avec des grains d’amidon de forme et de taille modifiées. De plus, plusieurs publications démontrent que l’altération de la division du plaste entraine des modifications de la taille et de la forme des grains d’amidon chez la pomme de terre ou le riz. Ces résultats suggèrent l’existence d’une voie commune de régulation entre le métabolisme de l’amidon et des facteurs spécifiques de la division du plaste. Cependant, le mécanisme moléculaire sous-jacent n’est actuellement pas élucidé. Dans un premier temps, nous proposons une analyse de la quantité d’amidon, de la structure, de la taille et du nombre de grains accumulés dans les lignées affectées pour la division des plastes. Ensuite, nous éclaircirons le lien unissant division du plaste et processus d’initiation du grain d’amidon par des approches génétiques basées sur la combinaison de mutations (entre des mutants de la voie amidon et des mutants de la machinerie de division de l’organelle). Nous établirons également la liste des partenaires interagissant avec SS4 par l’intermédiaire d’une technologie double hybride optimisée en utilisant la protéine SS4 comme appât. Nous confirmerons les interactions observées par une approche classique de double hybride (1-by-1) et d’autres techniques comme la coimmunoprécipitation. Les complexes protéiques seront localisés dans les feuilles ou les racines par BiFC et la dynamique de la localisation des protéines FtsZ, ARC et SS4 sera déterminée in vivo dans les feuilles et les racines. Enfin, nous éclaircirons la fonction de SS4 dans le processus d’initiation de la synthèse d’amidon par une double analyse basée sur (i) l’étude des paramètres cinétiques de l’enzyme et des produits de synthèse ; (ii) l’expression chez le mutant nul ss4- de formes recombinantes de la SS4 ayant soit des délétions du motif "coiled-coil" soit des modifications ciblées des sites catalytiques fortement conservés à travers toute enzyme de la même famille.