Structure et Fonction du Cofacteur à Molybdène – MC2

Le molybdène est un élément de transition incorporé dans le cofacteur d’une large classe de protéines appelées Molybdoenzymes (MOEs). Ces enzymes sont présentes dans tous les organismes vivants et étudiées dans des contextes divers, fondamentaux, médicaux ou industriels. Pourtant, elles restent peu étudiées par la communauté scientifique française, comparativement aux métalloenzymes à Fe, Cu ou Mn. Parmi les MOEs, les enzymes de la sous-famille de la DMSO réductase se caractérisent par un site actif constitué d'un ion Mo coordiné par les quatre thiolates de deux ptérines et, souvent, par un cinquième ligand protéique. Elles catalysent de façon spécifique des réactions variées qui sont fréquemment des transferts de groupements oxo: conversion nitrate/nitrite, DMSO/DMS, arsénite/arséniate etc... L’abondance de certains des substrats toxiques de ces enzymes (arsénite, chlorate, tellurite, séléniate...) dans des environnements pollués est un problème environnemental majeur. Les 20 chercheurs impliqués dans ce projet représentent tous les groupes de recherche français qui travaillent sur le mécanisme des MOEs. Nous avons collaboré ces 4 dernières années dans le contexte d'un précédent projet ANR (PCV 2006-2009). Notre objectif était d'étudier tous les aspects de la réactivité de trois enzymes "complexes" (i.e. contenant plusieurs centres métalliques) de la famille de la DMSO réductase: deux nitrate réductases et une arsénite oxydase. Nous avons publié nos résultats dans 14 articles (JACS, Mol Biol Evol, Biochemistry, J Biol Chem, J Phys Chem B) et contribué à la formation pluridisciplinaire de trois jeunes chercheurs. Nous avons remis en question des conclusions selon lesquelles certaines espèces précédemment caractérisées sont des intermédiaires catalytiques et montré que l'obstacle principal aux études du mécanisme est la difficulté à préparer des états dans lesquels le substrat est lié au molybdène. Cela nous a conduit à identifier de nouvelles questions qui font l'objet du projet MC2: notre objectif est de nous concentrer sur les relations structure/fonction du cofacteur à molybdène, pour identifier les déterminants moléculaires de la spécificité de substrat dans une série d'enzymes dont les sites actifs sont similaires. Dans ce but, nous avons augmenté à 6 le nombre de MOEs étudiées afin de couvrir une grande variété de structures et de fonctions. Nous avons acquis des équipements nouveaux (un Freeze- Quench pour piéger des intermédiaires réactionnels, des spectromètres MCD et RPE-pulsée pour les étudier, un robot de cristallisation etc.). Nous mettrons à profit les compétences des participants en biochimie, ingénierie génétique, cristallographie, cinétique, électrochimie, spectroscopies magnétiques avancées ou résolues en temps, modélisation. Nous piégerons et analyserons la structure d'intermédiaires catalytiques et modifierons chacun des éléments structuraux potentiellement critiques pour la fonction. Nous aborderons les questions transverses et ambitieuses qui débordent largement le champ thématique des MOEs, liées à la spécificité des enzymes vis-à-vis de leurs substrats, à la directionnalité des réactions catalysées. Au-delà de l’étude détaillée de chacun des systèmes, la comparaison des propriétés distinctes d’enzymes similaires restera le fil conducteur et l’approche originale privilégiée. Nos études apporteront un ensemble de connaissances nouvelles sur les déterminants structuraux de la réactivité de ces enzymes complexes, connaissances que nous mettrons à l’épreuve en utilisant la mutagenèse dirigée afin de détourner le fonctionnement d’une nitrate réductase pour inverser le sens de la catalyse ou bien augmenter sa réactivité vis-à-vis d'oxydes de métalloïdes toxiques. Le fait que les enzymes qui ont une activité physiologique de bioremédiation appartiennent toutes à la famille de la DMSO réductase suggère que les MOEs que nous étudions sont les gabarits idéaux pour élaborer intelligemment ce type de réactivité.