Structure et évolution des complexes de fusion membranaire des alphavirus – StrucEvolAlpha

Nous appliquons les méthodes de génétique inverse pour analyser la dépendance au cholestérol du phénomène de fusion du virus de la maladie du sommeil (Sleeping Disease Virus, SDV). Nous déterminons la structure de SDV par cryo-microscopie électronique. Nous exprimons le complexe de fusion de SDV et des domaines des protéines qui y participent.Nous cristallisons et déterminons la structure des ces protéines. Finalement, nous insérons le modèle obtenu par radiocristallographie dans la carte de reconstruction de cryo-microscopie.

Nous avons montré que le virus de la maladie du sommeil, un alphavirus, possède des propriétés de fusion in-vitro proches de celles du virus de la fièvre jaune, un flavivirus. La présence de cholestérol favorise la fusion mais celle-ci n'est pas strictement dépendante de cette présence.  Par contre in-vivo, l'entrée du virus de la maladie du sommeil est strictement dépendante de la présence de cholestérol dans la membrane  de la cellule hôte.
Nous avons montré que le peptide de fusion est suffisant pour induire la fusion de membranes artificielles, les liposomes. Tous ces résultats suggèrent que le cholestérol joue un rôle dans l'attachement du virus à sa membrane cible.
La structure du virus de la maladie du sommeil  et celle du virus de la fièvre jaune ont été résolues respectivement à 0.9 et 1.7 nm.

Nous avons déterminé la structure de SDV à une résolution de 0.9 nm, à partir de micrographies enregistrées sur des films argentiques. La résolution de la reconstruction pourrait être améliorée en utilisant les caméras à détection directe récemment développées. Pour atteindre ce but et publier nos données dans un journal de bon impact nous enregistrons actuellement des données sur une caméra à détection directe.

Non disponible.

La fusion membranaire est un mécanisme ubiquitaire qui est à la base de nombreux phénomènes biologiques fondamentaux : trafic vésiculaire au sein des cellules eucaryotes, fécondation d’un ovule par le spermatozoïde, contraction musculaire…. et infection virale. Tous ces processus impliquent que deux compartiments cellulaires, initialement délimités par une membrane biologique, entrent en contact puis mettent en commun leurs composants lipidiques et cytosoliques. Les membranes biologiques étant des structures très stables, l’intervention de protéines spécialisées est généralement nécessaire pour surmonter les barrières énergétiques des étapes conduisant à la fusion membranaire. Bien que les structures de nombreuses glycoprotéines virales aient été résolues à la résolution atomique, la plupart des étapes qui constituent le phénomène de fusion atomique restent hypothétiques. La connaissance de la structure de ces complexes demande en effet une étude des systèmes lipides-protéines qui est souvent délicate. Pour déterminer la structure de ces complexes lipides-protéines, des méthodes structurales, radiocristallographie et cryo-microscopie électronique (cryo-EM), mais aussi des méthodes de biologie moléculaires comme l’expression de virus par génétique inverse doivent être combinées. Cette demande de subvention consiste à appliquer une telle approche à l’étude d’un alphavirus qui a été découvert en France, le virus de la maladie du sommeil du saumon (SDV). Ce choix a été fait en considérant deux propriétés importantes de SDV. Premièrement, SDV n’étant pas un pathogène de l’homme, il peut être étudié dans des laboratoires P0 dans lesquels sont placés les équipements de biologie structurale (synchrotron, microscope électronique, fluorimètre…). Deuxièmement, SDV présente les séquences les plus divergentes pour les protéines structurales de tous les alphavirus connus. La comparaison de SDV aux autres alphavirus doit donc apporter des informations importantes sur l’évolution des virus.

Nous déterminerons la structure de SDV par cryo-EM. Une reconstruction préliminaire à une résolution de 1.5 nm a été obtenue. En utilisant un microscope Polara, et en augmentant le nombre d’images utilisées pour la reconstruction, nous espérons obtenir une résolution inférieure à 1nm et ainsi visualiser des éléments de structure secondaire.

Nous cristalliserons le complexe E1-E2-E3 de SDV et déterminerons la structure de ces glycoprotéines. En comparant ces données à celles qui ont été obtenues récemment sur le Chikungunya, évolution des virus, franchissement de la barrière d’espèce devraient être mieux compris.

Nous étudierons la fusion de SDV à des liposomes et visualiserons les étapes de la fusion des membranes virales. Ces études seront faites par tomographie électronique. En particulier nous espérons pouvoir visualiser le complexe de fusion et déterminer des paramètres importants comme le nombre minimal de molécules E1 nécessaires à sa formation. Pour faciliter cette tâche, nous construirons des virus mutés en utilisant un système d’expression par génétique inverse. Nous focaliserons notre attention sur une meilleure compréhension de la dépendance de la fusion à la présence de cholestérol dans la membrane cible.

La connaissance des structures des glycoprotéines de différentes espèces et des complexes qu’elles forment avec les membranes biologiques doit fournir une base rationnelle au développement de molécules antivirales qui empêchent les virus d’entrer dans leur cellule hôte.