Bases moléculaires de la maturation de l'épiblaste – EpiNodal

Culture de cellules ES, étude d'embryons de souris, triage des cellules par cytométrie en flux, analyse transcriptomique par PCR quantitative, culture d'embryons de souris ou de cellules ES en présence inhibiteurs pharmacologiques des voies de signalisation ou en présence de molécules signal, génétique, mutagénèse dirigée par recombinaison homologue, production de lignées de souris transgéniques, étude d'embryons mutants par microscopie confocale.

- Nous avons mis en évidence que la réponse des cellules ES à un signal Activine/Nodal est limitée dans le temps. Le maintien du signal ne permet pas de maintenir la réponse.
- Nanog/Gata6: nous avons montré que Nanog est requis pour former de l’épiblaste même en absence de Gata6.
- HBE est la première séquence régulatrice du gène Nodal à être activée chez l'embryon. Elle est indispensable à l'expression du gène Nodal en cellules ES. HBE est régulée par des facteurs de pluripotence et par la signalisation Activine/Nodal. Les facteurs qui se lient à HBE déterminent le statut de la chromatine des séquences régulatrices adjacentes, contrôlant ainsi leur activation à des stades ultérieurs lorsque les cellules se différencient.

Nos résultats ouvrent de nouvelles perspectives sur la façon dont les cellules répondent au signal Activine/Nodal ainsi que sur la façon dont les facteurs de pluripotence régulent l'expression de leurs gènes cibles, et donc la différenciation des cellules souches. Il y plusieurs milliers de séquences régulatrices comme HBE dans le génome des mammifères. Comprendre leur fonctionnement est susceptible d'avoir un impact important sur l'utilisation de cellules souches à des fins thérapeutiques, et sur notre compréhension de la formation des tumeurs.
Le mécanisme déterminant la façon dont les cellules répondent au signal Activine/Nodal ainsi que le mécanisme par lequel HBE contrôle l'activation d'une autre séquence régulatrice de Nodal vont être étudiés dans le détail en collaboration avec une équipe de biophysicien dans le cadre d'un nouveau projet financé par l'ANR.

Articles dans revues à comité de lecture:
Gasnier M, Dennis C, Vaurs-Barriere C and Chazaud C. (2013). Fluorescent mRNA labeling through cytoplasmic FISH. Nat. Protoc. 8, 2538-2547.

Papanayotou C, Benhaddou A, Camus A, Perea-Gomez A, Jouneau A, Mezger V, Langa F, Ott S, Sabéran-Djoneidi D, Collignon J. (2014). A novel Nodal enhancer dependent on pluripotency factors and Smad2/3 signaling conditions a regulatory switch during epiblast maturation. PLoS Biol 12(6): e1001890.

Artus J and Chazaud C. (2014). A close look at the mammalian blastocyst: epiblast and primitive endoderm formation. Cell. Mol. Life Sci. 71, 3327-338

Bessonnard S, De Mot L, Gonze D, Barriol M, Dennis C, Goldbeter A, Dupont G, and Chazaud C. (2014). Gata6, Nanog and Erk signaling control cell fate in the inner cell mass through a tristable regulatory network. Development 141:3637-3648. doi:10.1242/dev.109678

Papanayotou C and Collignon J. (2014). Activin/Nodal signalling before implantation: setting the stage for embryo patterning. Phil. Trans. R. Soc. B 369: 20130539.

Communications orales à conférences:
Collignon J. A shift in the regulation of Nodal expression during preimplantation development. EMBO workshop, Cell Biology of early mouse development. Cambridge, UK, 09/2012

Papanayotou C. Study of HBE, a novel Nodal regulatory element active in embryonic stem cells and in the embryonic epiblast.
5th STEMBRYO workshop, Zeliv, Czech Republic, 10/2012

Papanayotou C. Nodal is regulated by the pluripotency machinery in mESCs and in the embryonic epiblast. Developmental Biology Gordon Conference, Barga, Lucca, Italy, 07/2013

Collignon J. (2014). A novel Nodal enhancer dependent on pluripotency factors and Smad2/3 signaling conditions a regulatory switch during epiblast maturation. 6th STEMBRYO workshop, Cambridge, UK, 04/2014

Nous voulons comprendre les premières étapes du mécanisme qui lance une cellule pluripotente vers un état différencié. La pluripotence est définie comme la capacité de cellules embryonnaires à donner naissance à tous les lignages fétaux, y compris la lignée germinale. C’est la caractéristique de l’épiblaste, un tissu qui n’existe que de manière transitoire chez l’embryon de mammifère. Les propriétés de ce tissu changent rapidement pendant le développement, alors que son exposition à des signaux extrinsèques prépare sa différenciation prochaine en différents lignages. Le projet EpiNodal va disséquer les mécanismes moléculaires et cellulaires qui sous-tendent cette maturation de l’épiblaste chez l’embryon de souris. En particulier, il va caractériser les états distincts par lesquels l’épiblaste progresse, et étudier comment des interactions entre le facteur de pluripotence Nanog et la voie de signalisation Activine/Nodal contribuent à cette progression.
Au cours de nos travaux nous avons utilisé un élément de séquence auto-régulateur du locus Nodal pour générer un transgène fluorescent, appelé ASE-YFP. Nous avons trouvé que son expression est hétérogène dans l’épiblaste de l’embryon aux stades pré-implantatoires, d’une façon telle qu’elle semble marquer les cellules de l’épiblaste qui viennent de s’engager sur la voie de la maturation. Notre premier objectif est de caractériser la nature des cellules ASE-YFP+ entre E3.5 et E5.5, et donc les stades distincts par lesquels elles passent avant de constituer l’épiblaste post-implantatoire. Notre deuxième objectif est de caractériser les interactions entre les voies de signalisation Nodal, BMP et FGF aux stades péri-implantatoires et leurs rôles dans la maturation de l’épiblaste. Notre troisième objectif est de caractériser le rôle d’une nouvelle séquence régulatrice du locus Nodal dans la régulation génétique et épigénétique du gène, et de relier cela à la maturation de l’épiblaste. Nous appelons cet élément de séquence HBE. Il a été identifié en combinant une analyse phylogénétique du locus et l’analyse d’expériences de ChIP en cellules ES qui ont montré qu’il s’agissait d’une séquence sur laquelle tous les facteurs de pluripotence connus se lient avec avidité. Nos travaux seront conduits à la fois chez l’embryon de souris et dans des cultures de cellules pluripotentes dans le cadre d’un effort conjoint des équipes de J. Collignon (partenaire 1), à l’IJM à Paris et de C. Chazaud (partenaire 2) du GReD à Clermont Ferrand. S. Ott (partenaire 3), chef d’équipe bioinformaticien au Systems Biology Centre de Warwick University, fournira son expertise dans l’analyse statistique de données transcriptomiques. T. Hiiragi (partenaire 4), chef d’équipe du MPI pour la Biomédecone moléculaire, fournira son expertise dans la détermination du profil d’expression génétique de cellules isolées. Chaque partenaire a développé des réactifs spécifiques (lignées de souris, lignées cellulaires, constructions), ou perfectionné des outils et des méthodes (électroporation d’embryons, culture d’embryons, hybridation in situ, analyse de cellules uniques, analyse statistique) qui seront mis en commun pour parvenir à atteindre les objectifs de recherche du projet. Le projet va utiliser l’embryon de souris pour aborder un nombre de problèmes qui sont au cœur de développement actuels dans le domaine très compétitifs de la biologie des cellules souches : l’existence d’états de pluripotence distincts et comment les cellules passent de l’un à l’autre ; la façon dont les facteurs de pluripotence exercent leur contrôle sur l’expression de gène de développement ; le rôle des voies de signalisation dans le maintien ou la perte de la pluripotence ; comment des modifications locales de la chromatine contribuent à ces transitions. Progresser sur ces questions est essentiel à la compréhension du développement des mammifères et aux avancées technologiques qui permettront la thérapie cellulaire.