Machinerie de la Hsp90 et sa modulation via de nouvelles sondes moléculaires : aspects structuraux, dynamiques et fonctionnels – MACHsp90

Concernant les études pourtant sur le processus d’oligomérisation de la Hsp90 et l’influence des protéines co-chaperons, un des prérequis à été d’optimiser un protocole de pontage chimique afin de stabiliser les différents complexes dans le but de déterminer leur stœchiométries d’interaction. Une fois les complexes stabilisés, nous avons combiné des techniques biochimiques et biophysiques telles que l’ultracentrifugation analytique, la chromatographie d’exclusion stérique couplée ou non à la diffusion de lumière laser à angles multiples ainsi que la spectrométrie hautes masses. La spectrométrie hautes masses a notamment été essentielle pour comprendre comment les complexes se formaient. En ce qui concerne les inhibiteurs dérivés de la Novobiocine, nous avons élaboré un protocole de sélection basé comprenant plusieurs étapes : leur solubilité dans le diméthylsulfoxyde et en milieu aqueux, leur capacité à se lier à la Hsp90 et spécifiquement à son domaine C-terminal et nous allons prochainement tester leur activité antiproliférative sur différentes lignées de cellules cancéreuses. Pour cette partie du travail, nous avons utilisé des techniques biophysiques telles l’ultracentrifugation, la spectrophotométrie, la fluorimétrie et nous mesurons l’effet des molécules sur la croissance cellulaire pour déterminer leur activité antiproliférative (IC50). Dans la troisième partie de notre travail, nous avons utilisé les techniques biophysiques citées précédemment ainsi que la microscopie électronique à transmission pour caractériser le processus de fibrillation des peptides amyloïdes et l’effet de la Hsp90 sur< ces processus.

L’originalité de notre projet résidait dans le fait que nous nous intéressons aux roles des oligomères de la Hsp90. En effet, nous pensons que ces oligomères sont les formes actives en temps que chaperons moléculaires, les résultats que nous avons obtenus vont dans ce sens. En nous basant sur l’interaction de la Hsp90 avec ses protéines co-chaperons régulateurs Aha1 and p23, nous pouvons proposer un nouveau modèle de fonctionnement et de régulation du cycle de chaperonnage de la Hsp90. Concernant les inhibiteurs de la Hsp90 dérivés de la Novobiocine, à partir de la soixantaine de molécules synthétisées, une vingtaine d’entre-elles ont été pré-sélectionnées, quatre sont actuellement testées quant à leur activité antiproliférative sur lignées cellulaires cancéreuse. Ces nouvelles molécules sont potentiellement de nouveaux médicaments qui seront utilisables dans le traitement des cancers. Dans la dernière partie de notre travail, nous avons démontré que la Hsp90, et probablement sous forme oligomérique, est capable de réguler les processus de fibrillation de type amyloïde. Les inhibiteurs dérivés de la Novobiocine et spécifiques de la Hsp90 sont aussi des médicaments potentiels dans le traitement des maladies neurodégénératives de type amyloïde.

A compléter

L’optimisation du protocole de pontage chimique à été publié dans “Analytical chemistry”. Concernant le processus d’ oligomérisation de la Hsp90 et l’influence de ces co-chaperons a donné lieu à deux autres publications dans des journaux internationaux: “BBA Proteins and Proteomics” et “Analytical chemistry”. Les inhibiteurs dérivés de la Novobiocine ont fait l’objet de brevets déposés par l’équipe de chimistes, la compilation des résultats obtenus et ceux en cours d’obtention (études cellulaires en cours) donneront lieu à la rédaction d’un ou deux article qui seront soumis à des revues internationales. Le rôle de la Hsp90 dans la régulation des processus de fibrillation de type amyloïdes fait l’objet d’un article actuellement soumis à publication dans “FEBS Journal”. Nos travaux ont fait l’objet de présentations dans des congrès nationaux et internationaux.

Les protéines chaperons jouent un rôle essentiel dans la vie de la cellule, notamment par leur implication dans le processus de repliement des protéines néo-synthétisées. Parmi elles, la protéine de choc thermique de 90 kDa (Hsp90) joue un rôle particulier. Dans des conditions normales, la Hsp90 ne semble pas participer directement au repliement de novo des protéines, mais permet, avec l’aide de co-chaperons, à certaines protéines cibles d’acquérir leur conformation active. En condition de stress, la Hsp90 est surexprimée suggérant un rôle protecteur au niveau cellulaire. Si la Hsp90, protéine chaperon, est indispensable au bon fonctionnement de cellules saines, une telle activité représente un inconvénient dans la lutte contre le cancer, car la protection de protéines mutées conduit à la survie de cellules cancéreuses. C’est pourquoi la Hsp90 s’est révélée être une cible prometteuse pour de nouvelles stratégies de thérapies anticancéreuses, avec pour objectif d’enrayer simultanément de nombreuses voies d’oncogenèse. La compréhension du cycle de chaperon de la Hsp90 constitue par conséquent un défi majeur. Le cycle de la Hsp90 est étroitement lié à des changements importants de conformation. Notre compréhension de ces changements repose principalement sur les informations structurales qui se réfèrent aux états cristallins de la protéine Hsp90 recombinante tronquée et de son homologue procaryote HtpG. Nous avons récemment publié les premières structures de Hsp90 eucaryote entière observées en l’absence de nucléotides (apo-Hsp90), révélant ainsi la flexibilité intrinsèque de cette protéine. Bien que les changements de conformation aient été précédemment attribués à la liaison des nucléotides, nous avons montré qu’ils résultaient de la flexibilité intrinsèque du dimère de Hsp90. Ainsi, en tenant compte des propriétés dynamiques du dimère de Hsp90, nous avons revu le cycle ATP dépendant de la Hsp90. En marge de cette structure dimérique, la Hsp90 s’oligomérise en présence de cations divalents et sous l’influence d’une augmentation de température. Ces oligomères participeraient aussi au cycle de chaperonnage. Pour déchiffrer les détails de ce cycle, les inhibiteurs constituent des outils particulièrement intéressants. Dans le cas de la Hsp90, il en existe deux types. Les inhibiteurs appartenant à la famille de la geldanamycine (GA), qui sont actuellement les plus étudiés, et ceux dérivant de la novobiocine (Nvb). Des études ont démontré que chacune de ces deux classes d’inhibiteur agissait de manière différente sur le cycle de chaperonnage de la Hsp90. (Keppler, 2006, Fan and Young, 2006). En associant ces inhibiteurs à des nano particules d’or, nous disposerons de sondes moléculaires efficaces nous permettant d’étudier le mode de fonctionnement de la Hsp90. Le but principal de ce projet est de caractériser les bases moléculaires de l’action de la novobiocine et de ces dérivés les complexes Hsp90/co-chaperons et Hsp90/protéines clientes. Dans le but d’élucider clairement la structure et la dynamique de la Hsp90 au cours de son cycle de chaperonnage, ainsi que de comprendre des modulations de ce cycle, nous proposons un projet d’étude associant des compétences complémentaires en pharmaco-chimie et biologie structurale. En utilisant les approches structurales les plus modernes telles que la cristallographie aux rayon X et la cryo-microscopie électronique, nous comptons étudier différents homo (oligomères) et hétéro-complexes formés par la Hsp90, ses co-chaperons et/ou protéines cibles. L’influence des inhibiteurs sera étudiée afin de comprendre les détails du cycle de la Hsp90 au niveau moléculaire. Les résultats obtenus au cours de cette étude contribueront à la compréhension de l’activité oncogène de la Hsp90 et permettront le développement et/ou l’optimisation d’inhibiteurs pouvant être utilisés afin de traiter des cancers.