Approche RMN combinée au marquage de spin paramagnétique pour l'étude structurale et dynamique de complexes ARN/protéines: Application à l'ARN 7SK complexé à ses protéines – RNASPIN

Lors de travaux récents, nous avions cartographié l’interaction entre la tige-boucle HP1 de l’ARN 7SK et le domaine de liaison à l’ARN de la protéine Hexim1 (NLS) par RMN et identifié les éléments cruciaux pour l’interaction entre ces deux partenaires (Lebars et al., 2010). A l'heure actuelle, aucune donnée dynamique et structurale au niveau atomique n'est disponible concernant la structure de la tige-boucle HP1 de l’ARN 7SK libre ou complexée. Notre projet est d’élucider la structure de ce domaine par RMN afin de comprendre les bases moléculaires du mécanisme de reconnaissance HP1/NLS.
Le projet RNASPIN comporte donc 4 tâches majeures
(i) la production d’échantillons étudiables par RMN ;
(ii) la mise au point des marquages paramagnétiques de spin pour le développement d’une approche combinée RMN/RPE pour l’étude de l’ARN et de ses complexes ;
(iii) la détermination de la structure tridimensionnelle de l’ARN (analyse des données RMN, modélisation moléculaire) ;
(iv) l’application de l’approche RMN/RPE (analyse des informations dérivées des expériences impliquant la sonde paramagnétique, incorporation de ces données dans les calculs de modélisation).

Nous avons mis au point une technique enzymatique pour l’incorporation d’une ou plusieurs sondes paramagnétiques en position(s) spécifique(s) dans l’ARN. Notre méthode permet d’accéder à des combinaisons variées de marquage intéressantes pour les études RPE et RMN.
L’approche paramagnétique que nous développons, sera appliquée à l’affinement de la structure 3D d'un ARN que nous avons résolue par RMN, et à l’étude de l’interaction de l’ARN avec ses partenaires.

Les protocoles issus du développement de ce projet pourront permettre d’aborder des systèmes biologiques plus complexes non étudiables par les techniques de Résonance Magnétique Nucléaire classiques.

La méthode que nous avons mise au point pour le marquage paramagnétique de spin de l’ARN en position spécifique a été publiée dans un journal international à comité de lecture :
I. Lebars*, B. Vileno, S. Bourbigot, P. Turek, P. Wolff & B. Kieffer, 2014, «A fully enzymatic method for site-directed spin-labeling of long RNA«, Nucleic Acids Res., 42(15):e117, doi: 10.1093/nar/gku553.

Les autres résultats n'ont pas encore été soumis à publication.

Les ARNs jouent un rôle majeur dans l’expression des gènes. En tant qu’intermédiaires entre l’ADN et les protéines, les ARNs sont à la fois porteurs de l’information génétique et de signaux de reconnaissance. Les architectures complexes formées par les ARNs sont en effet impliquées dans de nombreux processus biologiques dans tous les organismes. De telles structures sont stabilisées par des liaisons hydrogènes, l’empilement des bases ou des interactions électrostatiques.
Les structures d’ARN constituent des sites de fixation pour d’autres partenaires tels des ligands, d’autres acides nucléiques ou des protéines. Les complexes ribonucléoprotéiques sont effectivement impliqués dans de multiples processus cellulaires, ou dans le développement de pathologies. La modulation de ces phénomènes de reconnaissance ARN/protéines intervenant dans la transcription, l’épissage d’ARN messager, la traduction ou le développement de rétrovirus, pourrait conduire à la conception de nouveaux agents thérapeutiques.
L’élucidation des mécanismes d’interaction entre les ARNs et leurs partenaires est donc devenue un enjeu majeur en biologie moléculaire et structurale. L’étude des phénomènes de reconnaissance ARNs/protéines est fondamental pour la compréhension de la régulation de l’expression des gènes. La clef pour comprendre la fonction biologique de ces complexes est d’étudier leur structure et leur dynamique. La Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) est la technique la plus puissante pour l’étude dynamique des ARNs et de ses partenaires en solution. De plus, au cours de ces dernières années, de nombreuses techniques ont été développées pour dépasser les limites de la RMN. Parallèlement, la Résonance Paramagnétique Electronique (RPE) a connu un essor considérable pour l’étude de la structure et de la dynamique de macromolécules et des complexes. Tout d’abord appliquée avec succès aux protéines, la RPE a été récemment utilisée pour caractériser les interactions ARNs/protéines.
Dans le projet présenté, nous proposons d’initier et de développer une approche combinée RMN/RPE pour l’étude structurale et dynamique de sous-unités du complexe 7SK/HEXIM1/P-TEFb/LaRP7/MePCE impliqué dans le développement de plusieurs pathologies tels le cancer, le VIH et l’hypertrophie cardiaque.
Le complexe P-TEFb ("positive transcription elongation factor"), formé par la kinase cycline-dépendante Cdk9 et la cycline T1/T2, active la transcription en phosphorylant le domaine C-terminal de l'ARN polymérase II (ARNpol II). L'ARN 7SK agit en tant que régulateur de la transcription par l'ARNpol II, en coopération avec la protéine HEXIM1, en séquestrant P-TEFb dans le complexe ribonucléoprotéique 7SK/HEXIM1/P-TEFb.
Des travaux récents ont montré que P-TEFb et HEXIM1 ont d'autres partenaires: la protéine LaRP7 et l'enzyme methylphosphatase MePCE. LaRP7 module la transcription en se liant à une région conservée de 7SK (3'-UUU-OH) et en séquestrant le complexe P-TEFb. Pour l'activation de la transcription, P-TEFb est relargué et LaRP7 reste liée à l'ARN. MePCE ajoute un monomethyl phosphate à l'extrémité 5' de 7SK. LaRP7 et MePCE agissent de façon coopérative pour assurer la stabilité de 7SK et promouvoir l'assemblage du complexe ribonucléoprotéique. A l'heure actuelle, aucune donnée dynamique et structurale au niveau atomique n'est disponible concernant la structure de l'ARN 7SK en interaction avec ses partenaires.
Notre projet est de caractériser au niveau atomique les interactions entre la tige-boucle HP1 de 7SK et HEXIM1 d'une part, et la tige-boucle HP4 de 7SK et LaRP7 d'autre part, en utilisant la RMN et la RPE. Les données structurales obtenues permettront de mieux comprendre le mécanisme de reconnaissance entre l'ARN 7SK et ces protéines. Cette étude apportera ainsi des informations supplémentaires pour élucider le rôle majeur de 7SK dans la régulation de la transcription par l'ARNpol II.