Blanc SVSE 2 - Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes : Biologie cellulaire, développement

Imagerie de l’expression génétique dans la cellule – IMAGenEx

Une vue en temps réel de l’expression des gènes.

La régulation de l’expression des gènes est un processus fondamental des organismes vivants. Ce projet développe et utilise des outils permettant de visualiser, directement dans des cellules vivantes et en temps réel, l’expression des gènes.

Comprendre l’expression des gènes à l’échelle de cellules uniques.

Des cellules identiques génétiquement et partageant le même environnement au sein d’une population clonale sont néanmoins différentes au niveau de l’expression de leurs gènes et de leurs phénotypes. Une part importante de cette variabilité provient de variations aléatoires au niveau de la transcription des gènes et contribue à la variabilité phénotypique des cellules et organismes. Cependant, du fait du manque de technologies adaptées, ces phénomènes sont très mal connus. De manière similaire, bien que la transcription soit étudiée depuis des dizaines d’années et soit une étape fondamentale de l’expression des gènes, la dynamique de ce processus dans les cellules vivantes est mal caractérisée.

Une compréhension de la transcription à l’échelle de la cellule unique nécessite des méthodes capables de détecter des molécules uniques d’ARNm, et ce dans des cellules fixées ou vivantes. Nous avons développé des outils capables de répondre à ces besoins, basés sur de la microscopie de fluorescence. Ainsi il est maintenant possible de marquer des ARN dans des cellules vivantes ou fixées et de détecter chacune des molécules ciblée avec une bonne résolution spatiale (50-100 nm en fixé) et une bonne résolution temporelle (10 images/secondes). Pour cela, nous avons travaillé sur la méthode de marquage, l’acquisition des images, et leur traitement mathématique.

Avec des cellules fixées, nous sommes capables d’analyser des populations de centaines de cellules et de compter combien de molécules d’un ARN donné sont présentes dans chacune d’elle. Avec des cellules vivantes, nous pouvons visualiser la synthèse d’un ARN donné en temps réel, ainsi que le mouvement de molécules uniques d’ARN polymérases. Nous avons montré que la transcription se fait sous la forme de groupes d’ARN polymérases, lesquelles transcrivent simultanément un gène donné. Nous avons mesuré la taille de ces groupes et la fréquence avec laquelle ils sont formés, et nous avons observé que selon les cas, la régulation d’un gène se fait soit en augmentant la taille des groupes, soit leur fréquence. Ce mode de transcription par groupe contribue à la variabilité entre cellules en augmentant la variabilité intrinsèque de la transcription.

Ce projet ouvre des perspectives pour comprendre la régulation des gènes impliqués dans le cancer comme c-fos, ainsi que la diversité phénotypique souvent observée dans les cancers, ou encore le fonctionnement de certains rétrovirus.

FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images. Nat Methods. 2013, 10:277-8. Mueller F, Senecal A, Tantale K, Marie-Nelly H, Ly N, Collin O, Basyuk E, Bertrand E*, Darzacq X*, Zimmer C*. *: co-corresponding authors.

Cette publication décrit un programme d’analyse des images obtenues après détection des molécules uniques d’un ARNm donné dans les cellules fixées.

Real-Time Dynamics of RNA Polymerase II Clustering in Live Human Cells. Science. 2013 Jul 4. [Epub ahead of print]. Cisse II, Izeddin I, Causse SZ, Boudarene L, Senecal A, Muresan L, Dugast-Darzacq C, Hajj B, Dahan M, Darzacq X.

Cette publication décrit le mouvement de molécules uniques d’ARN polymérase II dans les cellules vivantes. Elle va à l’encontre d’un modèle proposé précédemment, où de nombreux gènes se regroupaient aux mêmes endroits pour créer des « fabriques transcriptionelles ».

L’expression des gènes est un processus biologique fondamental qui a fait l’objet de décennies d’études génétiques et biochimiques. Alors que les machineries impliquées sont bien caractérisées du point de vue biochimique et structural, on comprend mal comment ce processus se déroule réellement dans les cellules. Bien que relativement récentes, les techniques d’imagerie sur cellules vivantes ont révélé de nombreux résultats inattendus. Par exemple, il est apparu que la transcription est un processus discontinu, dans lequel des gènes individuels oscillent entre des états «allumés» et «éteints», conduisant notamment à la notion de «bruit transcriptionnel». Plus généralement, compte tenu du faible nombre de molécules impliquées (1 ou 2 séquences d’ADN, quelques molécules d’ARN), tous les processus intervenant dans l’expression des gènes doivent être compris au niveau des molécules uniques. Un défi majeur est donc de mesurer l’activité de machineries moléculaires uniques dans leur contexte cellulaire.

Les techniques pour mesurer les molécules d’ARN et d’ADN à l’échelle cellulaire existent, mais dans ce projet nous comptons réaliser un bond technique pour mesurer positions et distances avec une résolution de 10-20 nm, et caractériser des molécules uniques. Nous mettrons en commun notre expertise distincte pour développer et appliquer les outils nécessaires pour répondre à trois questions centrales :

Premièrement, nous analyserons la topologie des ANR messagers (ARNm), pour déterminer s’ils sont compacts, allongés, ou circulaires. Hormis le fait que l’ARNm est circularisé pour initier la transcription, peu de données sont disponibles sur sa topologie. Nous mesurerons la distance entre les extrémités 5’ et 3’ d’ARNm rapporteurs dans des cellules fixées, et entre une extrémité et le milieu. Ceci indiquera si la forme de l’ARNm dépend de sa localisation intracellulaire et répondra à plusieurs sous-questions : l’ARNm est-il plus compact dans le nucléoplasme pour faciliter sa diffusion ? Est-il déplié pour traverser le pore ou passe-t-il comme une particule compactée ? Quelle est la topologie de l’ARNm dans le cytoplasme, peut-on visualiser sa circularisation, et par là identifier les molécules en cours de traduction ?

Deuxièmement, nous analyserons l’activité de molécules d’ARN polymérase II isolées au niveau de gènes uniques. Nous utiliserons les fluctuations stochastiques de l’initiation transcriptionnelle pour capturer l’activité de polymérases uniques ou en faible nombre sur un gène rapporteur. De ces données nous tirerons plusieurs paramètres fondamentaux: la fréquence et distribution des événements d’initiation au cours du temps ; les taux d’élongation moyens et instantanés ; les fréquences et durées de pauses transcriptionnelles ; les taux et distributions de la formation d’extrémités 3’. Les résultats indiqueront si ces processus sont déterministes ou stochastiques, et dans quelle mesure ils sont régulés.

Troisièmement, nous analyserons les liens entre la position nucléaire d’un gène, son activité transcriptionnelle, et sa capacité à former des boucles entre les extrémités 3’ et 5’. Dans la levure, les gènes Gal se relocalisent vers la périphérie lors de l’induction transcriptionnelle. Par ailleurs, ces gènes forment des boucles 3’-5’ qui sont requises pour la mémoire transcriptionnelle, i.e. la réactivation rapide après une première induction. Bien que plusieurs études ont corrélé le positionnement des gènes a leur activité, des mesures simultanées et précises de la position et de l’activité transcriptionnelle par microscopie quantitative font jusqu’ici défaut. De même, la topologie des gènes a été analysée par des méthodes biochimiques, qui fournissent des moyennes sur des populations et ne sont pas pleinement quantitatives. Nous utiliserons des techniques d’imagerie à haute résolution pour analyser quantitativement le lien entre positionnement des gènes, formation de boucles, et activité transcriptionnelle.

Coordination du projet

Edouard BERTRAND (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE LANGUEDOC-ROUSSILLON) – Edouard.Bertrand@igmm.cnrs.fr

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

ENS CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE ILE-DE-FRANCE SECTEUR PARIS B
CNRS CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE ILE-DE-FRANCE SECTEUR OUEST ET NORD
CNRS-IGMM CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE LANGUEDOC-ROUSSILLON

Aide de l'ANR 550 000 euros
Début et durée du projet scientifique : - 36 Mois

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