Pontage covalent « clickable » optimisé pour la spectrométrie de masse, application à l’analyse structurale des pili de type IV de Neisseria meningitidis – CLICKMASSLINK

Sonder l?organisation des protéines et de leurs interactions dans un système vivant est indispensable à la compréhension du rôle de ces protéines in vivo. Chez de nombreux pathogènes, dont N. meningitidis, la virulence dépend essentiellement de l?expression d?organelles filamenteuses que sont les pilis de type IV. L?élément central de ces pili est une unique protéine de 17 kDa, dite piline majeure, organisée en une structure hélicoïdale formant une fibre flexible et résistante. Différentes conditions cellulaires mènent à des changements d?organisation des pili et à la modulation de la virulence, sans que cette organisation soit connue. Les techniques usuelles de biologie structurale, comme la cristallographie par rayons X ou la RMN ne peuvent étudier que des complexes purifiés et cristallisables. De ce fait, l?étude de complexes protéiques dans leur état fonctionnel reste un défi. La combinaison entre spectrométrie de masse et pontage covalent, apparue comme prometteuse il y a quelques années, reste très peu utilisée, probablement en raison de l?absence de réactifs réellement spécifiques. Dans ce projet nous proposons la synthèse d?une nouvelle génération d?agents pontants spécifiquement conçus pour la spectrométrie de masse, dans lesquels un groupe à charge piégée pourra être ajouté par de la chimie « emboîtable » (click chemistry) après pontage in vivo. Par conséquent le premier objectif de ce projet est la conception et la synthèse d?agents pontants trifonctionnels comportant deux groupes réagissant sur des protéines et une fonction azido. L?ajout d?une charge piégée par « click chemistry » permettra d?augmenter l?efficacité d?ionisation de ces peptides, et comme nous l?avons montré, d?améliorer la couverture de séquence en combinaison avec la dissociation par capture d?électron (ECD). Les avantages majeurs de cette approche par « click-chemistry » sont (i) d?une part de pouvoir mettre au point un seul agent pontant à partir duquel une panoplie de groupes fonctionnels pourront être ajoutés (ii) d?autre part de pouvoir effectuer le marquage au moment le plus propice des différentes étapes de séparation et purification. La première application de cette méthodologie portera sur l?étude structurale de pilis de type IV de Neisseria meningitidis, un complexe de virulence exprimé par ce pathogène bactérien. L?application de notre approche innovante à ces complexes apportera un moyen unique pour l?étude des différents niveaux d?organisation structurale de ce facteur de virulence et en particulier d?en étudier la régulation par l?effet structural de modifications post-traductionnelles. La pluridisciplinarité est au c?ur de ce projet, car il repose sur une collaboration étroite entre des chercheurs dans les domaines de la chimie organique, de la chimie analytique et de la microbiologie appliquée à des problèmes biologiques, en biologie et médecine. Les organiciens apporteront un savoir-faire pour la construction de nouvelles molécules. Les spécialistes de spectrométrie de masse à haute résolution, experts dans les modes de fragmentation utilisant les charges piégées, apporteront la technique ainsi que des connaissances sur les avantages et limitations des techniques de pontage actuelles. Un microbiologiste, spécialisé dans l?étude de pathogènes bactériens apportera les interrogations biologiques sur l?organisation et la structure des facteurs de virulence dans le contexte des pathologies humaines.