Structure et fonctions des Beta-1,2 mannosyl transferases de Candida albicans – caBMT

Ce projet porte sur les beta-1,2 mannosides, structures rares
dans le monde vivant contribuant à la virulence de C. albicans
par leurs propriétés d'adhésines immunomodulatrices. Nous
avons découvert la famille de 9 gènes (CaBMTs) codant pour
les enzymes nécessaires à leur synthèse et établi
partiellement les fonctions de 6 d'entre elles agissant sur
deux substrats connus pour être b-mannosylés.
Parallèlement nous avons découvert que la majorité des
protéines pariétales de C. albicans pourtant très étudiées par
ailleurs, pouvaient être b-mannosylées selon des processus
qui restent à définir. Enfin des résultats récents suggèrent
que la régulation des Bmts serait post transcriptionnelle.
Cette complexité relevant d'un des aspects fondamentaux de
la biologie de C. albicans nous impose une recherche
d'amont.
Elle associe 3 groupes aux compétences complémentaires en
biologie cellulaire et moléculaire, biochimie structurale et
chimie de synthèse. Son but est de comprendre le
fonctionnement des Bmts, définir leurs substrats, leurs
mécanismes de régulation et leur impact sur la réponse
cellulaire.
Le projet est fondé sur la mise en oeuvre de méthodes
complémentaires de biologie cellulaire et moléculaire,
biochimie structurale et chimie organique. La production de
protéines recombinantes chez la souche sauvage et les
mutants bmtD permettra d'abord de définir leur mode de bmannosylation
par des analyses en RMN et SM ainsi que
l'impact de la délétion de gènes. La surexpression de
différentes formes tronquées rBmt dans P. pastoris est
destinée à déterminer les motifs structuraux essentiels à leur
activité. Celle-ci sera évaluée grâce à la préparation d'une
banque de substrats endogènes purifiés complémentée par la
création d'une « glycobanque » d'oligosaccharides de
synthèse. Ces oligosaccharides seront pourvus de traceurs
fluorescent et/ou associés à la desthiobiotine afin de
permettre leur analyse sur substrats solides suivie de leur
libération (Catch and release). Comme précédemment ,
l'analyse des modifications induites sur les sites potentiels de
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O et N glycosylation sera effectuée par RMN et SM. Le
meilleur couple candidat pour la définition du domaine
catalytique des Bmts fera l'objet d'essais de co-cristallisation
afin de définir la structure tridimensionnelle lors de
l'interaction enzyme/substrat.
Cette approche sera complémentée d'analyses en STD. La
régulation de l'expression des gènes codant pour les Bmts
chez les souches sauvages et les mutants bmtsD de C.
albicans sera analysée par northern blot. En parallèle,
l'expression des Bmts sera quantifiée et la localisation de ces
enzymes dans les différents compartiments cellulaires sera
examinée notamment lors d'interactions avec les cellules
hôte. Enfin, l'analyse de l'impact fonctionnel de la bmannosylation
de glycoconjugés cible sur la réponse de l'hôte
sera réalisée à partir de substrats des glycobanques
naturelles et de synthèse avant et après l'activité
enzymatique (par exemple sur les précurseurs du PLM ).
Leur fixations et activités de stimulation seront analysées vis
à vis de macrophages WT et KO pour différents gènes de
lectines ou TLRs, ainsi que vis à vis de cellules HEK
transfectées avec les récepteurs des glycannes de C. albicans
Les résidus mannose -sous forme de mannoconjuguésconstituent
jusqu'à 30% de la paroi des levures. L'étude de
leur biosynthèse chez S. cerevisiae a amené à des
connaissances essentielles sur les processus de glycosylation
des cellules eukaryotes parallèlement à la définition de leurs
rôles dans les communications cellulaires. Chez C. albicans, le
statut de commensal opportuniste s'accompagne de la
présence massive de b-1,2 oligomannosides dont le rôle dans
la pathogénie a été clairement établi. Ce programme
multidisciplinaire fondé sur l'analyse de l'expression des
gènes de BMTs, l'étude fonctionnelle de leurs produits sur un
panel d'accepteurs, l'analyse des modifications induites nous
paraît un investissement dont l'ambition est adaptée à
l'importance des questions posées. Nous attendons donc des
progrès fondamentaux dans les connaissances sur la
biogénèse de la paroi de C. albicans. Il est clair que toute
application potentielle de ces recherches soit en termes de
conception d'inhibiteurs ou issues des procédures originales
de synthèse chimiques sera envisagée.