Analyse à haute resolution de la chromatine pendant la reparation des cassures Doubles Brins de l'ADN – ChIP'ing breaks

Les lésions double brin de l?ADN (DSBs) représentent un danger important pour la cellule, puisqu?elles peuvent conduire à des mutations et des réarrangements chromosomiques, eux même impliqués dans la progression des cancers. Les cellules eucaryotes ont alors développé des processus de réparation efficaces, essentiellement la recombinaison homologue (HR) et la voie NHEJ (Non Homologous End Joining), pour faire face à ce type de lésions. Cependant l?organisation de l?ADN en chromatine complique la détection et la réparation des DSBs, et les processus de réparation s?accompagnent alors de remodelages majeurs de la chromatine. Faute d?outils adaptés, les changements de la chromatine induits autour des DSBs, ainsi que leur fonctions, restent largement inconnus et ceci particulièrement dans les cellules mammifères. Nous avons établi un nouveau système expérimental, basé sur l?utilisation d?une enzyme de restriction fusionnée au domaine de liaison au ligand du recepteur aux oestrogenes (AsiSI-ER), permettant d?induire de façon parfaitement controlée, plusieurs lésions séquences spécifiques dans les cellules mammifères. Ce système, combiné avec des approches « genome wide » (ChIP-chip, GCC..) donne l?opportunité unique d?étudier à haute résolution et de façon statistique, les remodelages de la chromatine qui accompagnent la réparation de DSBs localisées dans des contextes chromatiniens variés, ainsi que leur fonction dans les différentes étapes de la réparation (détection, signalisation, choix de la voie de réparation, ..). A l?aide de ce système nous avons d?ors et déjà cartographié pour la première fois une modification de la chromatine induite par les DSBs : gammaH2AX (manuscrit soumis). L?utilisation de ce système cellulaire (ainsi que ses dérivatifs) va nous permettre à présent d?adresser des questions encore parfaitement inexplorées quant au rôle de la chromatine dans la réparation des DSBs. En premier lieu, nous voulons établir par ChIP-chip le profil des modifications de la chromatine et des protéines de réparation autour des DSBs. La description précise du paysage chromatinien avant et après induction des lésions nous permettra non seulement de mieux connaître les modifications de la chromatine qui accompagnent la réparation, mais aussi l?influence de la structure de la chromatine pre-existante sur l?efficacité de la réparation (essentiellement le choix de la voie de réparation). Toujours dans le but de mieux comprendre la fonction de la chromatine dans la réparation des DSBs, nous exploiterons également un modèle très largement utilisé pour étudier le rôle de la chromatine dans la régulation de la transcription : la « compensation de dose » chez la drosophile. En effet le chromosome X des mâles de drosophile présente une structure très particulière de la chromatine, qui permet d?égaliser la transcription des gènes du chromosome X entre mâles et femelles. Nous tirerons profit de cette différence majeure de structure chromatinienne entre chromosome sexuel et autosomes pour étudier l?influence de la chromatine sur la réparation des DSBs. Nous planifions de réaliser ces études dans des lignées cellulaires de drosophiles mâles (SL2) et femelles (Kc) transfectées de façon stable avec AsiSI-ER. Nous étudierons également la reorganisation tridimensionnelle du genome au sein du noyau après induction des DSBs par la technique de GCC (Genome Conformation Capture), en collaboration avec Dr O'sullivan, dans le but de mieux comprendre les évenements de regroupement des DSBs au sein de focis, ainsi que leur fonction. Enfin, nous developperons des modèles animaux (drosophile et souris transgéniques), de façon à étudier in vivo, le rôle de la chromatine dans la réparation des DSBs dans divers tissus (neurones, cellules germinales, cellules souches?) La réparation des DSBs est impliquée de façon centrale dans le maintien de l?intégrité des organismes multicellulaires, ce qui est illustré par les nombreuses pathologies associées à des dysfonctionnements de la réparation des DSBs (cancer, maladies neuro-dégéneratives,...). L?ensemble de ces études apportera sans aucun doute des réponses aux questions cruciales qui restent aujourd?hui en suspend en ce qui concerne la réparation des DSBs dans le contexte de la chromatine, réponses nécessaires au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. De plus la réalisation de ce projet générera également une grande quantité de données ainsi que des méthodologies bioinformatiques, susceptibles d?intéresser d?une façon générale la communauté scientifique travaillant sur la chromatine et l?épigénome.