– HOLOTRANS

Le bon fonctionnement de toutes cellules vivantes requiert que environ la moitié des protéines synthétisées dans le cytosol soient envoyées à travers la membrane cellulaire (dans le cas des protéines exportées) ou insérées dans celle-ci (dans le cas des protéines membranaires). La translocation des protéines se fait au moyen d?un canal protéique appelé translocon au niveau de la membrane endoplasmique. Le corps du translocon est un complexe protéique membranaire hétéro-trimérique (SecY, SecE et SecG chez les eubactéries) et il est conservé dans tous les règnes du vivant. On connait peu de choses sur la structure et la fonction des composants additionnels de la machinerie de holo-translocation (SecD, SecF et YidC) qui sont essentiels chez les eubactéries. En dépit de leur rôle central, la fonction de ces sous-unités est complètement inconnue à ce jour. Cela est dû en grande partie à l?absence d?un holo- translocon SecYEG-DF-YidC purifié et reconstitué et aussi à l?absence de données structurales sur ce gros complexe multi protéique transmembranaire. En utilisant un nouveau système de vecteur basé sur la recombinaison en vue de l?expression de complexes multi protéiques chez E. coli, nous avons, pour la première fois, sur-exprimé et purifié l?holo-translocon SecYEG-DF-YidC. A partir de ce holo-translocon purifié, nous sommes maintenant dans une position unique pour entreprendre, avec minutie, la caractérisation fonctionnelle et structurale de ce complexe protéique membranaire extrêmement important. Notre projet sera divisé en cinq parties complémentaires: (1) Nous résolvions la structure de l?holo-translocon par cryo-microscopie électronique et analyse des particules isolées. (2) Nous étudierons la translocation co-traductionnelle en résolvant la structure de l?holo-translocon en présence d?un ribosome en cours de traduction à l?aide de la cryo-microscopie électronique et l?analyse des particules isolées. En utilisant les structures existantes du ribosome, de SecYEG et l?homologie entre SecDF et AcrB, nous construirons un modèle quasi atomique de l?holo-translocon. (3) Nous analyserons minutieusement au niveau moléculaire la fonction de l?holo-translocon lors de la translocation des protéines, en collaboration avec Prof. Ian Collinson, Bristol, UK. La modulation fonctionnelle de la translocation post traductionnelle dirigée par SecA et son effet sur la force motrice des protons seront étudiés. (4) La st?chiométrie des sous-unités dans le complexe holo-translocon reste entièrement inconnue à ce jour. Nous analyserons la st?chiométrie des composants et l'architecture de l?holo-translocon par spectrométrie de masse, en collaboration avec Prof. Carol V. Robinson, Cambridge, UK. (5) Nous réaliserons des expériences de cristallisation du holo-translocon à la fois pour une analyse par microscopie électronique a deux dimensions (avec Prof. Ian Collinson, Bristol) et aussi pour la cristallographie aux rayons X en utilisant les services de cristallisation haut-débit qui font partis du Partnership in Structural Biology (PSB) ici à Grenoble. La compréhension au niveau moléculaire de l?export des protéines, de l?intégration et du repliement des protéines membranaires donnera non seulement un aperçu fondamental sur un processus biologique d?une importance capitale, mais pourrait également, à l?avenir, contribuer au design de nouveaux antibiotiques très attendus.