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Manipulation du système génétique des mitochondries dans les cellules végétales – MITOMANIP

Résumé de soumission

Chez les eucaryotes, les mitochondries assurent des fonctions vitales dans la production d?énergie, les processus d?oxydo-réduction, les voies métaboliques et la mort cellulaire programmée. Le système génétique mitochondrial fournit des protéines essentielles pour la survie des cellules. Chez les plantes, les processus génétiques mitochondriaux sont complexes et influencent des caractères d?une grande importance agronomique comme la fertilité, la vigueur, les fonctions chloroplastiques ou la compatibilité croisée. Les mutations non létales de l?ADN mitochondrial entraînent généralement une stérilité mâle cytoplasmique (CMS), un caractère largement utilisé en agronomie pour les croisements, la sélection variétale et le maintien des hybrides. La manipulation du système génétique mitochondrial des plantes présente donc un intérêt à la fois fondamental et appliqué. Cependant, il s'est avéré impossible de transformer les mitochondries dans les cellules végétales avec les méthodes conventionnelles. Nous avons développé des stratégies alternatives de manipulation génétique des mitochondries de plante basées sur les mécanismes physiologiques de trafic des acides nucléiques entre les compartiments cellulaires. Dans beaucoup d'organismes, la population d'ARN de transfert (ARNt) codée par le génome mitochondrial est insuffisante pour assurer la synthèse protéique et les mitochondries importent du cytosol des ARNt codés par le génome nucléaire. Notre laboratoire a démontré l'existence de ce processus spécifique chez les plantes supérieures. De concert avec l'investigation approfondie de la voie d'import, nous avons ensuite développé deux stratégies pour introduire des ARN d'intérêt dans les organelles. Dans la première, l'import des ARN est médié par une protéine-navette. Cette approche est un outil puissant pour l'import efficace d'ARN étrangers dans les mitochondries isolées et pour les tests fonctionnels in organello. Elle a été utilisée avec succès pour importer des ARN-précurseurs et des ARN messagers (ARNm) qui ont ensuite été maturés et modifiés de façon post-transcriptionnelle. La seconde stratégie permet de transporter des ARN dans les mitochondries dans des cellules végétales transformées de manière stable. Nous avons montré qu'un ARN "passager" attaché à l'extrémité 5' d'un mime d'ARNt et exprimé à partir d'un transgène nucléaire est transporté dans les mitochondries des cellules transformées. Cette approche nous a permis d'obtenir l'import d'un trans-ribozyme spécifique dans les mitochondries de cellules transgéniques et de provoquer le "knockdown" efficace d'un ARNm mitochondrial majeur (brevet CNRS en cours). Sur la base de ces deux stratégies, le projet vise la manipulation génétique des mitochondries de plante in vitro, dans des suspensions cellulaires et dans des plantes entières. Nous souhaitons caractériser plus avant les processus de régulation mitochondriaux, identifier de nouvelles fonctions mitochondriales, étudier le mécanisme de la CMS et générer des lignées CMS de façon dirigée grâce à l'import d'ARN. Le premier objectif est de provoquer le "knockdown" d'ARNm mitochondriaux majeurs (nad9 et atp9) par l'intermédiaire d'un trans-ribozyme et de déterminer l'impact sur l'expression génétique mitochondriale et nucléaire. Comme très peu de choses sont connues sur la traduction mitochondriale chez les plantes, le second objectif est de valider avec une protéine-marqueur (la GFP) la traduction in organello d'un ARNm exogène importé. Des protéines mitochondriales courantes (NAD9 et ATP9) seront ensuite surexprimées après import de leurs ARNm dans les organelles in vivo et les conséquences moléculaires et physiologiques de la surexpression seront analysées. Il n'a pas été possible jusqu'à présent de faire de la génétique inverse dans les mitochondries. Le troisième objectif est donc d'adresser dans les mitochondries des trans-ribozymes destinés à provoquer le "knockdown" de transcrits conservés codant pour des polypeptides de fonction inconnue (mat-r et mttB) ou des candidats d'ARN non codants (mnc1 et mnc2). L'analyse du phénotype moléculaire et physiologique correspondant permettra de comprendre les fonctions de ces composants mitochondriaux. Par l'altération de fonctions mitochondriales, la plupart des approches des trois premiers objectifs sont susceptibles de provoquer une CMS dans des plantes entières. D'un autre côté, la CMS due à des mutations dans le génome mitochondrial est généralement associée avec la présence, dans les organelles, de transcrits particuliers portant des cadres de lecture ouverte chimériques. Le quatrième objectif est d'adresser dans les mitochondries de cellules sauvages et de plantes entières des ARN normalement trouvés dans les lignées CMS et d'obtenir l'expression des polypeptides chimériques (ORF77 et ORF138) dans les organelles. Cette approche permettra de mieux comprendre les mécanismes de la CMS et d'établir une nouvelle voie pour générer des lignées CMS.

Coordination du projet

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

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Début et durée du projet scientifique : - 0 Mois

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