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Nouveaux réactivateurs de l’Acetylcholinestérase empoisonnée – ReAChE

Résumé de soumission

L'Acétylcholinestérase (AChE) est une enzyme clef pour la transmission de l'influx nerveux. Cette enzyme possède une gorge hydrophobe d'environ 20 Å séparant le site catalytique, et un site périphérique situé à l'entrée de la gorge. L'inhibition irréversible de cette enzyme est la source d'action des neurotoxiques organophosphorés, insecticides et agents de guerre chimique. L'enzyme est inhibée par phosphorylation de la sérine du site catalytique sous forme de diester phosphonique. Sans intervention extérieure, le diester phosphonique est transformé par l'enzyme en acide phosphonique (phénomène de vieillissement de l'AChE empoisonnée). Le diester phosphonique peut être hydrolysé, plus ou moins efficacement suivant l'organophosphoré utilisé via des nucléophiles ? comme des oximes. Cependant, malgré 50 années de recherche sur les oximes, aucun réactivateur efficace et universel n?a pu être mis en évidence. L'objectif de cette étude est d'optimiser les conditions de réactivation pour les principaux neurotoxiques. L'approche choisie réside dans l'observation que les réactivateurs les plus efficaces de l'AChE sont des homo ou hétéro-dimères, portant tous une fonction oxime réactive, et capable de se lier aux deux sites de liaison. Le but est donc d'utiliser cette synergie entre les différents sites de liaison de l'enzyme pour conduire à un positionnement optimisé du nucléophile vis-à-vis de la sérine phosphorylée. Elle s'appuie donc sur plusieurs aspects : 1- La synthèse de chimiothèques de nucléophiles ?, ligands du site phosphorylé de l'enzyme empoisonnée d?une part, et de ligands du site périphérique (ou de la gorge hydrophobe) de l'enzyme d?autre part. Ces ligands du site périphérique, connus (phénanthridiniums, isoquinolines), ou originaux (coumarines, aflatoxine ou des hybrides dérivés de la cytisine) étant choisis pour leur capacité à induire une modification conformationnelle significative du site catalytique de l'enzyme, permettant de positionner le nucléophile en position réactive vis-à-vis de la sérine phosphorylée. 2- L'évaluation du mode de liaison des différents ligands ciblés par modélisation moléculaire du site actif de l'enzyme empoisonnée, permettant de déterminer l'accessibilité du site actif d'une part, et d'autre part l'influence relative de chaque liaison sur le positionnement du nucléophile par rapport à la sérine phosphorylée. 3- La synthèse d'hétérodimères permettant aux deux phénomènes d'agir en synergie via deux stratégies, la première fondée sur un design rationnel, qui s?appuie sur la connaissance de la structure des sites actifs de l?enzyme, la seconde via une adaptation du principe de chimie click in situ. Ces deux stratégies pourront être évaluées de concert via l'adjonction, sur les chimiothèques de nucléophile et de ligand du site périphérique de point d?attache pour des bras de liaison ou des bras réactifs complémentaires susceptibles de réagir entre eux via une réaction sensible aux facteurs entropiques (réaction click in situ). 4- La production de l?enzyme recombinante humaine et de souris, empoisonnée par différents organophosphorés toxiques, et l?évaluation de la réactivation par des tests de criblage haut débit. 5- La cristallisation des nouveaux réactivateurs dans le site actif de l'enzyme humaine recombinante, afin de mettre en évidence leur positionnement, et d'évaluer les modifications susceptibles d'être apportées pour optimiser leurs propriétés. Les résultats attendus dans cette étude sont donc de trois ordres : d'une part offrir un traitement plus efficaces vis-à-vis des empoisonnements liés aux neurotoxiques organophosphorés, qu'ils soient chroniques (pesticides), ou aiguës (armes de guerre chimiques), que ce soit via de nouvelles fonctions réactivatrices, ou via des hétérodimères agissant également de façon allostérique. D'autre part élargir les possibilités offertes par la chimie click in situ. Enfin, la modélisation des interactions et la cristallisation du complexe réactivateur?enzyme devraient permettre de comprendre le mode d'action et d'ouvrir des pistes pour de nouveaux réactivateurs plus efficaces. Le projet s?appuie sur la possibilité de réunir dans un même effort de collaboration l'ensemble du spectre des tâches requises : modélisation moléculaire, chimie organique, production d'enzymes recombinantes, capacité de travailler avec les véritables agents neurotoxiques, et donc d'obtenir quantité raisonnable des enzymes phosphorylées, cristallisation des protéines et diffraction des rayons X.

Coordination du projet

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

Aide de l'ANR 0 euros
Début et durée du projet scientifique : - 0 Mois

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